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龙图腾网获悉山东大学申请的专利一种大片段DNA级联组装的方法、系统及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN118813656B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-06-03发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202410793906.7，技术领域涉及：C12N15/70；该发明授权一种大片段DNA级联组装的方法、系统及应用是由颜富;韩丽媛;张友明设计研发完成，并于2024-06-19向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种大片段DNA级联组装的方法、系统及应用在说明书摘要公布了：本发明提出了一种大片段DNA级联组装的方法、系统及应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种大片段DNA级联组装的方法及系统。本发明基于整合酶系统的细菌染色体组装技术，通过使用两套正交的丝氨酸整合酶系统，能够高效地依次将大片段DNA组装成超长DNA；该方法能够在大肠杆菌中将DNA进行级联组装，尤其是能够通过多轮组装将100kb以上的大片段DNA依次组装成超长的DNA，在DNA组装、基因组大尺度改造、人工染色体的合成和人工生命体的构建等方面具有重要的应用价值。

本发明授权一种大片段DNA级联组装的方法、系统及应用在权利要求书中公布了：1.一种在细菌基因组插入大DNA片段的方法，其特征在于，包括：S1：构建含φC31int整合酶表达盒及其识别位点attPφ或attBφ的受体菌，S2：向S1中受体菌中转化含有φC31int整合酶的识别位点、TG1int整合酶的识别位点、外源DNA片段的供体质粒，诱导重组，从而将外源DNA片段整合入基因组的宿主细胞；S3：将含有TG1int整合酶的辅助质粒I，在S2所得的外源DNA片段整合入基因组的宿主细胞中诱导表达，从而获得去除穿梭质粒骨架的宿主细胞；S4：多轮重复步骤S2-S3，获得多片段插入的宿主细胞；或，S1’:构建含φC31int整合酶识别位点attPφ或attBφ的受体菌，S2’：向S1’所得受体菌中导入含有φC31int整合酶和TG1int整合酶基因的辅助质粒II；其中，attPφ和attBφ为φC31int整合酶的识别位点，attBT和attPT为TG1int整合酶识别位点；所述供体质粒包括串联的attPφ、attBφ、筛选标记1、attBT、穿梭质粒骨架、attPT、外源DNA片段；S3’：向S2’所得受体菌中转化含有φC31int整合酶的识别位点、TG1int整合酶的识别位点、外源DNA片段的供体质粒，诱导重组，从而将外源DNA片段整合入基因组的宿主细胞，并去除穿梭质粒骨架；S4’：多轮重复步骤S2’-S3’，获得多片段插入的宿主细胞；所述筛选标记1为荧光蛋白编码基因；所述步骤S4或S4’中，所述多轮重复分奇数轮和偶数轮，其中奇数轮和偶数轮所用的供体质粒在宿主细胞中的筛选抗性不同、外源DNA片段的序列相同或不同；所述奇数轮片段整合载体为pBAC-attPφ-attBφ-mch-attBT-ampR-rpsL-YAC-attPT-p15A-kmR；所述偶数轮片段整合载体为pBAC-attPφ-attBφ-mch-attBT-cmR-rpsL-YAC-attPT-p15A-kmR；片段attPφ-attBφ用引物对amp-attP-FBAC-attB-R退火延伸获得；所述amp-attP-F核苷酸序列为CCTAGGGGATCCAACCCAGCCCGCCTAATGAGCGTAGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGGCGTAGGCATGCG；所述BAC-attB-R核苷酸序列为TTCATTAGGTTGTTCTGTCCGAATTCGCGGCCGCTACGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCACCCGCATGCCTACGCCCCCAAC；所述外源DNA片段≥30kb。

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