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龙图腾网获悉博雅干细胞科技有限公司申请的专利羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115475181B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-09-23发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211289924.9，技术领域涉及：C12N5/0775；该发明授权羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途是由魏卿;肖海蓉;刘庆喜设计研发完成，并于2022-10-21向国家知识产权局提交的专利申请。

本羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途在说明书摘要公布了：本发明涉及羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途。一方面，本发明涉及从羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述外泌体具有50～200nm的平均粒径，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％。本发明的外泌体是使用羊膜间充质干细胞经IL‑1β处理后在低氧分压条件下培养得到的。还涉及使用外泌体调控外周血单个核细胞PBMC分泌TNF‑α水平的方法，以及使用羊膜间充质干细胞分离提取的外泌体和其制法。本发明外泌体具有生物调控性能。

本发明授权羊膜间充质干细胞源外泌体及其用途在权利要求书中公布了：1.使用羊膜间充质干细胞分离提取外泌体的方法，该方法包括如下步骤： 1将P3~P8代的羊膜间充质干细胞接种至T75培养瓶中，每瓶接种2~10×105个细胞，添加MSC完全培养基10~20ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养20~30小时使细胞贴壁，再向培养液中添加IL-1β至浓度8~12ngmL、酒石酸钠0.125~0.175mgmL、盐酸赖氨酸2.0~2.5mgmL，继续培养20~30小时；所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的： a从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4·12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液； b用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管； c组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；所述混合酶消化液的组成为：0.1mgml的I型胶原酶，0.3mgml的II型胶原酶，0.1mgml的透明质酸酶和0.05mgml的中性蛋白酶； d分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养： 滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10%FBS、100μgmL青霉素、50μgmL链霉素、0.01~0.05%硝酸硫胺、0.05~0.1%麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基； 组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养；2天后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养； eP1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞；所述胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液； f纯化培养和传代：以5000~15000个cm2的接种密度将羊膜P1代细胞接种于T75培养瓶中用完全培养基培养，第3-4天全换液；继续培养至第11天，用胰酶消化液消化细胞，用完全培养基终止消化，1400rpm离心5分钟，收集沉淀即为P2代羊膜间充质干细胞；所述胰酶消化液是包含0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液； gP2代细胞再以步骤f的方式纯化培养和传代，得P3代细胞；以此类推，依次得到P3~P8代间充质干细胞； 2吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5%CO2培养箱中培养直至细胞融合度≥80%； 3吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2%O2、5%CO2培养箱中培养42~56小时； 4吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：以250~350g、4℃离心8~12分钟，吸取上清液至另一离心管中；以1500~2500g、4℃离心18~25分钟，吸取上清液至另一离心管中；以8000~12000g、4℃离心25~35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；以80000~120000g、4℃离心75~120分钟，弃上清； 5向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000~120000g、4℃离心75~120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体；所得外泌体表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81，膜蛋白CD9的阳性表达率大于70%，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80%。

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