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龙图腾网获悉中国人民解放军军事科学院军事医学研究院申请的专利一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120555367B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-10-17发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202511052850.0，技术领域涉及：C12N5/10；该发明授权一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系及其应用是由李岩;赵越;张文盛;孟腾;袁一铭;邱业峰设计研发完成，并于2025-07-30向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系及其应用在说明书摘要公布了：本发明涉及变异或遗传工程领域的一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系及其应用。本发明的CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系的构建与应用包括如下步骤：步骤一、构建含有MSTN基因靶标序列的Cas9的定点敲除质粒；步骤二、构建含有MSTN基因同源臂的质粒Donor‑1kbHA‑mCherry；步骤三、构建含有荧光蛋白mCherry表达框的供体DNA：步骤四、将含有荧光蛋白mCherry表达框的供体DNA与步骤一所述的定点敲除质粒共同转染进入绵羊成纤维细胞系，获得红色荧光标记的绵羊成纤维细胞系。

本发明授权一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系及其应用在权利要求书中公布了：1.一种CRISPR介导的红色荧光标记绵羊成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、构建含有MSTN基因靶标序列的Cas9的定点敲除质粒； 所述定点敲除质粒的构建方法为： 步骤1、将单链DNA退火形成双链DNA； 分别对如SEQIDNo:2和SEQIDNo:3所示的DNA序列进行溶解，接着，混合并放入PCR仪中进行退火，获得退火Mix； 步骤2、用BsmBI酶切pX330-Gal4Cas9质粒； 所述pX330-Gal4Cas9质粒含有Gal4BD片段，所述Gal4BD片段的核苷酸序列为SEQIDNo:6；所述Gal4BD片段通过柔性linker融合至Cas9蛋白的N端；所述柔性linker为32aa：SGGS×2-XTEN-SGGS×2； 步骤3、将退火Mix和步骤2的酶切产物用T4DNA连接酶试剂盒进行连接反应，获得步骤一所述定点敲除质粒； 步骤二、构建含有MSTN基因同源臂的质粒Donor-1kbHA-mCherry： 将所述MSTN基因的上游1kb的序列设为左同源臂，下游1kb的序列设为右同源臂；所述Donor-1kbHA-mCherry同源修复质粒通过无缝克隆技术将所述左同源臂、CMV-mCherry-pA表达结构、所述右同源臂、pmCherry-N1质粒这4个DNA片段相连构建得到； 所述CMV-mCherry-pA表达结构的核苷酸序列为SEQIDNo:4的第1008-2628位； 步骤三、构建含有荧光蛋白mCherry表达框的供体DNA： 将步骤二获得的Donor-1kbHA-mCherry用引物进行扩增，从而获得UAS序列的荧光蛋白mCherry表达框供体DNA；所述UAS序列的核苷酸序列为SEQIDNo:5的第3622-3638位； 步骤四、红色荧光标记绵羊成纤维细胞系的转染： 将含有荧光蛋白mCherry表达框的供体DNA与步骤一所述的定点敲除质粒共同转染进入绵羊成纤维细胞系，获得红色荧光标记的绵羊成纤维细胞系。

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