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龙图腾网获悉复星安特金(成都)生物制药有限公司申请的专利一种提取和纯化CRM197蛋白的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120757623B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-25发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202511284565.1，技术领域涉及：C07K14/34；该发明授权一种提取和纯化CRM197蛋白的方法是由张年;白津;杨敏;张超;何刚;黄放;黄倩;陈苗苗;谢蓉娴;李若玥;王倩;周冬梅;熊骏民;段梦奇设计研发完成，并于2025-09-10向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种提取和纯化CRM197蛋白的方法在说明书摘要公布了：本发明提供了一种提取和纯化CRM197蛋白的方法，属于疫苗制备技术领域。具体而言，本发明采用无信号肽、无融合标签添加的方法在大肠杆菌细胞质中表达CRM197蛋白，并将菌体进行渗透压法反复冻融+高渗溶液+低渗溶液处理以提取细胞质中可溶性表达的CRM197蛋白，然后经过两步柱层析阴离子柱层析+疏水柱层析，获得较高纯度的目标蛋白。本发明提供的CRM197蛋白提取和纯化方法简单、高效、易于操作、无需复杂设备辅助，且具有成本优势。

本发明授权一种提取和纯化CRM197蛋白的方法在权利要求书中公布了：1.一种提取和纯化大肠杆菌细胞质中可溶性表达的CRM197蛋白的方法，其特征在于，所述CRM197蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，采用渗透压法提取CRM197蛋白，并采用两步柱层析法纯化CRM197蛋白，其中： 1渗透压法提取CRM197蛋白： S1.培养结束后离心收集菌体，将菌体在-80℃和室温之间进行反复冻融，所述反复冻融的次数为3次； S2.将菌体按20-40mLg湿菌的比例重悬于高渗溶液中，冰水浴孵育10-30min后将菌体8000-12000rpm离心10-30min，一方面收集菌体沉淀，另一方面收集上清液得到溶液Ⅰ； S3.将上步得到的菌体沉淀按20-40mLg湿菌的比例重悬于低渗溶液中，冰水浴孵育10-30min后将菌体8000-12000离心10-30min，收集上清液为溶液Ⅱ； S4.将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合，得到CRM197提取液； 其中，所述高渗溶液为：30-100mMTris，5-10mMEDTA，20%蔗糖，pH=8.0； 其中，所述低渗溶液为超纯水； 2两步柱层析法纯化CRM197蛋白： 包括阴离子柱层析和疏水柱层析： A.阴离子柱层析： A1采用离子层析BufferA平衡阴离子层析柱，其中，阴离子层析柱为NanoGel50Q层析柱，离子层析BufferA为：20mMTris–HCl，pH8.0； A2将CRM197提取液加载到平衡后的层析柱； A3利用离子层析BufferA和离子层析BufferB组成的洗脱液进行梯度洗脱，离子层析BufferB为20mMTris–HCl+0.5MNaCl，pH8.0；其中，洗脱液包含如下两种梯度：10%B，30%B，其中B代表离子层析BufferB，该百分比为体积比，洗脱液中余量为离子层析BufferＡ；收集30%B洗脱产物，以用于疏水柱层析； B.疏水柱层析： B1利用疏水层析BufferA平衡疏水层析柱，其中，疏水层析柱为CytivaButylSepharose4FF层析柱，疏水层析BufferA为20mMTris–HCl+2MNaCl，pH8.0； B2针对阴离子柱层析30%B洗脱产物，先采用氯化钠将其电导率调节至与疏水层析BufferA的电导率一致，然后将其加载到平衡后的疏水层析柱； B3利用疏水层析BufferA和疏水层析BufferB组成的洗脱液进行梯度洗脱，疏水层析BufferB为20mMTris–HCl，pH8.0；其中，洗脱液包含如下两种梯度：50%B，90%B，其中表示疏水层析BufferB，该百分比为体积比，洗脱液中余量为疏水层析BufferＡ；收集90%B洗脱产物，得到CRM197蛋白纯化产物。

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