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龙图腾网获悉杭州阅景生物科技有限公司申请的专利一种自预染荧光蛋白Marker制备方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN113156103B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-12-05发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202110289149.6，技术领域涉及：G01N33/533；该发明授权一种自预染荧光蛋白Marker制备方法是由陈美荷;崔建波;陈华芳设计研发完成，并于2021-03-18向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种自预染荧光蛋白Marker制备方法在说明书摘要公布了：本发明涉及生物工程技术领域，尤其为一种自预染荧光蛋白Marker制备方法，其方法包括如下步骤：制备亚基混合物：将1毫克发光蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟，得到上清液和沉淀物，用移液枪完全吸走上清液，仅保留沉淀部分。本发明的荧光蛋白Marker是将天然提取的荧光蛋白，其分子量为20‑300kDa，与能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的抗体Fc区蛋白或肽共价偶联，由于荧光蛋白自带颜色，从而实现蛋白即是预染蛋白，又是荧光蛋白的目的，无需转膜染色或X光片成像，使电泳更为简单，由于荧光信号非常强，即使微量的蛋白，也能实现电泳检测，得到理想的电泳图。

本发明授权一种自预染荧光蛋白Marker制备方法在权利要求书中公布了：1.一种自预染荧光蛋白Marker制备方法，其特征在于：其方法包括如下步骤： 步骤一、制备亚基混合物： 1.1、将1毫克发光蛋白沉淀置于离心管中，4℃条件下高速离心5分钟，得到上清液和沉淀物，用移液枪完全吸走上清液，仅保留沉淀部分； 1.2、向沉淀部分中添加200微升缓冲液充分进行溶解，然后在4℃条件下高速离心10分钟后，去除沉淀，得到上清溶液； 1.3、将上清溶液用快速脱盐柱或透析袋脱去盐和保护剂，将脱盐后的发光蛋白溶液中加入二硫苏糖醇DTT，得到终浓度为20-50微摩尔升的混合物，然后常温反应90分钟后，得到亚基混合物； 步骤二、制备衍生化的融合蛋白： 2.1、将1毫克融合蛋白溶解于200微升0.1MPBSpH7.2-7.4缓冲溶液中，配制成5毫克毫升的溶液； 2.2、将双功能试剂溶解于无水二甲基亚砜DMSO配制成50毫克毫升的母液，每毫克的融合蛋白添加20微升的琥珀酰亚胺-4-N-甲基马来酰亚胺环已烷-1-碳酸酯SMCC，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，使融合蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的融合蛋白； 2.3交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的融合蛋白过柱，收集融合蛋白峰，并调节浓度； 制备衍生化的融合蛋白还包括融合蛋白的巯基化: 预制：将1毫克proteinAGL融合蛋白溶解于200微升0.1MPBSpH7.2-7.4缓冲溶液中，配制成5毫克毫升的溶液，得到融合蛋白纯品，具体的包括以下步骤： A、3-2-吡啶二巯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP溶解于无水二甲基亚砜DMSO配制成50毫克毫升的母液； B、取融合蛋白纯品，浓度调整到5毫克毫升以上为宜，按照每毫克融合蛋白加入SPDP溶液，轻轻混匀，在室温下搅拌反应0.5-1.5小时，用离心式脱盐柱，去除多余SPDP，收集液为SPDP-融合蛋白； C、三2-羧乙基膦TCEP溶于0.1MPBSpH值7.4，0.1MNaCl，配成2毫克毫升的溶液，按每毫克的SPDP-融合蛋白加入20微升的TCEP溶液，轻轻混匀，在室温下反应10-15分钟； D、上PD-10柱分离出巯基化的，并调节浓度至3mgml， 步骤三、交联制备： 3.1将亚基混合物逐滴加入到衍生化的融合蛋白中，边加边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟或4℃过夜，即可实现共价交联而得到自预染荧光蛋白Marker制品； 所述步骤三的3.1还包括将活化的融合蛋白逐滴加入到巯基化的融合蛋白中，边加边用混匀器轻轻混匀，铝箔封好后于室温旋转偶联120分钟或4℃过夜，使巯基与马来酰亚胺基实现共价交联而得到自预染荧光蛋白Marker制品。

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