江南大学;嘉兴未来食品研究院刘延峰获国家专利权
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龙图腾网获悉江南大学;嘉兴未来食品研究院申请的专利一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用获国家发明授权专利权,本发明授权专利权由国家知识产权局授予,授权公告号为:CN119552790B 。
龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-17发布的发明授权授权公告中获悉:该发明授权的专利申请号/专利号为:202411740156.3,技术领域涉及:C12N1/21;该发明授权一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用是由刘延峰;陈坚;堵国成;李江华;刘龙;武耀康;吕雪芹;周雨桑设计研发完成,并于2024-11-29向国家知识产权局提交的专利申请。
本一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用在说明书摘要公布了:本发明公开了一种产N‑乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用,属于基因工程技术领域。本发明通过敲除6‑磷酸果糖激酶、甘油激酶引入甘油激酶突变体、用葡萄糖促进扩散转运蛋白替换PTS磷酸转移酶I并进行启动子优化,使重组大肠杆菌可以葡萄糖和甘油双碳源生长、合成N‑乙酰神经氨酸同时乙酸生成量极低。在此基础上,本发明又敲除了6‑磷酸果糖激酶编码基因pfkB,引入来自运动假单胞杆菌的异源ED途径,并通过拷贝数优化和RBS强度优化,使孔板水平下的产量进一步提升达到9.44gL。
本发明授权一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用在权利要求书中公布了:1.一种重组大肠杆菌在N-乙酰神经氨酸合成过程中降低副产物乙酸中的应用,其特征在于,所述重组大肠杆菌基于宿主菌所做的改造为: 敲除6-磷酸果糖激酶编码基因pfkA和6-磷酸果糖激酶编码基因pfkB,敲除甘油激酶编码基因并在该位点整合表达甘油激酶突变体编码基因,敲除PTS磷酸转移酶I编码基因并在该位点整合表达葡萄糖促进扩散转运蛋白编码基因,分别在基因组上ettA基因位点和ymgF基因位点整合表达含有6-PG脱水酶编码基因和KDPG醛缩酶编码基因的表达框; 所述葡萄糖促进扩散转运蛋白编码基因由核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的启动子启动表达,所述葡萄糖促进扩散转运蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示,所述甘油激酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述6-PG脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示;所述KDPG醛缩酶的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示; 所述含有6-PG脱水酶编码基因和KDPG醛缩酶编码基因的表达框中还包括调控原件RBS:当在ettA基因位点整合表达框时,调控6-PG脱水酶编码基因的RBS为SEQIDNO.17所示的序列,调控KDPG醛缩酶编码基因的RBS为SEQIDNO.19所示的序列;当在ymgF基因位点整合表达框时,调控6-PG脱水酶编码基因的RBS为SEQIDNO.18所示的序列,调控KDPG醛缩酶编码基因的RBS为SEQIDNO.20所示的序列; 所述重组大肠杆菌的宿主菌为大肠杆菌BL21DE3ΔcheW::P6-glmSA,启动子P1控制下neuC基因在pspG基因终止位点过表达,ΔmotA::P1-glmM-P4-glmUglmSA,启动子P1控制下NemneuB基因在yho基因终止位点过表达,ΔwecBΔmanAΔpykA,ΔnagΔnanATEΔmanXYZ,其中,P1启动子核苷酸序列如SEQIDNO.5所示,P4启动子核苷酸序列如SEQIDNO.8所示,P6启动子核苷酸序列如SEQIDNO.10所示; 所述应用包括采用重组大肠杆菌以复合碳源进行发酵的步骤,所述复合碳源中含有葡萄糖和甘油的质量比为1:12。
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