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龙图腾网恭喜合肥燃音生物科技有限公司申请的专利一种大脑类器官模型及其制备方法与应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN114657127B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2024-09-13发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202210185202.2，技术领域涉及：C12N5/079；该发明授权一种大脑类器官模型及其制备方法与应用是由陈璞;李彬;赵稳设计研发完成，并于2022-02-28向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种大脑类器官模型及其制备方法与应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种大脑类器官模型及其制备方法与应用，所述方法包括：获得具有边界限制的单层贴壁生长的多能干细胞，加入EB形成培养基维持培养4～6天；后采用神经诱导培养基培养2～6天；后吸弃培养基，用预冷的Matrigel包被，固化后，依次更换神经分化培养基培养3～5天、诱导成熟培养基培养10～30天，获得大脑类器官模型。本发明首次实现了从单层细胞培养生成大脑类器官模型，可实现高通量、一步法构建形态均一的类器官，并可原位观察类器官生长、发育全过程。

本发明授权一种大脑类器官模型及其制备方法与应用在权利要求书中公布了：1.一种大脑类器官模型的制备方法，其特征在于，所述方法为以下方法一至方法九中的任意一种：方法一的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.5mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法二的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.008mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法三的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.03mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.2mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法四的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.8mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法五的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为正方形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为1mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法六的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为正三角形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.43mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法七的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为十字形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法八的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取24孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于24孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法九的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取24孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于24孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.5mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正六边形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型。

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