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龙图腾网恭喜江南大学申请的专利一种恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN117165618B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-04-01发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202310472681.0，技术领域涉及：C12N15/78；该发明授权一种恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法是由刘春立;底心怡;白仲虎;刘秀霞;杨艳坤设计研发完成，并于2023-04-27向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法在说明书摘要公布了：本发明公开了一种恶臭假单胞菌中4‑异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法，以恶臭假单胞菌F1PseudomonasPutidaF1代谢途径中存在的4‑异丙基苯甲酸cumate诱导的cym操纵子为基础，替换其原有表达用启动子以及表达目的基因，通过组合多阻遏位点，得到改造后的cym操纵子，从而使得荧光蛋白表达强度提高；本发明确定了所述诱导系统的诱导剂在恶臭假单胞菌中的有效响应范围，同时筛选得到响应最好的多阻遏位点诱导系统。

本发明授权一种恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法在权利要求书中公布了：1.一种恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系的构建方法，其特征在于：包括，以恶臭假单胞菌F1（PseudomonasPutidaF1）代谢途径中存在的4-异丙基苯甲酸诱导的cym操纵子为基础替换其原有表达用启动子以及表达目的基因，通过组合阻遏位点，构建得到改造后的cym操纵子；所述替换其原有表达用启动子以及表达目的基因，包括,以质粒pBBR1-pTrc为模板，设计引物1、引物2通过PCR扩增抗性基因Kan、复制子pBBR1oriV、pBBR1Rep得到片段1；以恶臭假单胞菌F1纯化基因组为模板，设计引物3、引物4通过PCR扩增阻遏蛋白基因cymR得到片段2；设计引物5、引物6通过PCR扩增cym操纵子阻遏位点CuO1和启动子得到片段3；设计引物7、引物8通过PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP得到片段4；片段1、片段3和片段4进行Gibson组装，培养提取得到pBBR1-lacI-CuO1-eGFP质粒；以质粒pBBR1-lacI-CuO1-eGFP为模板，设计引物9、引物10通过PCR扩增除lacI基因部分得到片段5；片段5进行Gibson组装，培养提取得到pBBR1-CuO1-eGFP质粒，核苷酸序列如SEQIDNO:13所示；以质粒pBBR1-CuO1-eGFP为模板，通过酶切位点XbaI和HindIII对质粒进行双酶切，产物通过胶回收得到线性化载体片段6；片段2和片段6进行Gibson组装，培养提取得到pBBR1-cymR-CuO1-eGFP质粒，核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；以pBBR1-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-CuO1-eGFP质粒为模板，设计引物11、12通过PCR扩增两个质粒载体得到片段7和片段8；片段7、片段8分别进行Gibson组装即得到pBBR1-Ptac-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP质粒，所述改造后的操纵子质粒包含pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP质粒；其中，所述引物1为pBBR1vector-F，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；引物2为pBBR1vector-R，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；引物3为cymR-F，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；引物4为cymR-R，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；引物5为CuO1-F，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；引物6为CuO1-R，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；引物7为eGFP-F，核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；引物8为eGFP-R，核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；引物9为dlacI-F，核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；引物10为dlacI-R，核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；引物11为tac-F，核苷酸序列如SEQIDNO:11所示；引物12为tac-R，核苷酸序列如SEQIDNO:12所示；其中，所述改造后的cym操纵子包括编码阻遏蛋白基因cymR、阻遏位点CuO1、外源引入的启动子tac、绿色荧光蛋白eGFP；其中，所述4-异丙基苯甲酸诱导的cym操纵子序列中的阻遏位点CuO1如SEQIDNO:23所示；将改造后的cym操纵子质粒转入恶臭假单胞菌KT2440中，作为恶臭假单胞菌中4-异丙基苯甲酸诱导的高强度表达体系；该表达体系于恶臭假单胞菌中能够在4-异丙基苯甲酸的添加下有效响应，所述4-异丙基苯甲酸诱导浓度为50~800mgL，所述改造后的cym操纵子在400mgL4-异丙基苯甲酸诱导剂浓度下达到最高荧光蛋白表达响应强度。

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