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龙图腾网恭喜华中农业大学申请的专利利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN113215161B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-04-01发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202110609717.6，技术领域涉及：C12N15/113；该发明授权利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法是由金双侠;张献龙;王茂军;丁霄;惠凤娇设计研发完成，并于2021-06-01向国家知识产权局提交的专利申请。

本利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法在说明书摘要公布了：本发明涉及除草剂技术领域，且公开了利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，包括以下步骤：1GhEPSP基因的sgRNA设计：选择陆地棉5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶5‑Enolpyruvylshikimate‑3‑phosphatesynthase，EPSP合酶为验证基因，利用在线软件CRISPR‑Phttp：cbi.hzau.edu.cncgi‑binCRISPRLeietal2014在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列，并且在编辑窗口内C‑T突变改变氨基酸功能的靶点，最终选择1个sgRNA用来构建单碱基系统植物表达载体。该利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法，在棉花中首次成功应用棉花基因组特性的单碱基编辑系统对棉花GhEPSP实现单碱基突变，突变位点未见其他作物报道，通过叶片草甘膦涂抹实验，表现出一定的草甘膦耐受性，提高了棉田除草效率，降低了人工除草成本，防范棉田超级杂草。

本发明授权利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性植物的方法在权利要求书中公布了：1.利用单碱基编辑技术创造除草剂抗性棉花的方法，其特征在于，包括以下步骤：1GhEPSP基因的sgRNA设计：选择陆地棉5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶为验证基因，利用在线软件CRISPR-P在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列，并且在编辑窗口内C-T突变改变氨基酸功能的靶点，最终选择1个sgRNA用来构建单碱基系统植物表达载体；2sgRNA与GhBE3载体的连接：靶标插入GhBE3载体序列为tRNA-sgRNA-gRNA的重复序列，需要中间载体转换，第一次PCR的引物如下：pRGEB32-7S：AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG，将sgRNA加到反向引物的接头上，GhEPSPAS：TTCCACCGGGAAGACCACCCTGCACCAGCCGGGAAT，下划线的碱基是sgRNA序列，以PGTR载体为模板进行PCR扩增tRNA序列，获得tRNA+sgRNA，利用一步克隆试剂盒将tRNA+sgRNA片段分别连接到pGREB32-GhU6-7载体的BsaI酶切位点处，利用HpaI和SbfI双酶切pGREB32-GhU6-7，将目的片段连接到GhBE3载体的HpaI和SbfI双酶切位点处；3农杆菌介导的遗传转化：A、将剥好的棉花种子用0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4d；B、将下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌侵染，弃菌液，并吹干；C、将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃，暗培养1d；D、将下胚轴转入到附加2,4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，25d用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；E、当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基中，进一步分化成胚状体；F、将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根健康的小苗；G、将小苗转到清水中，进行炼苗，一周后，转移到温室；4测序检测编辑：提取的棉花嫩叶阳性基因组DNA，以阳性DNA为模板，扩增GhEPSP基因，然后将PCR片段连入pGEM-Teasy载体，将连接产物热激转化大肠杆菌感受态TOP10，挑取的单克隆进行阳性检测并进行Sanger测序，将测序结果与靶标序列比对；5叶片涂抹草甘膦：将农达稀释200倍，涂抹棉花叶片，一周后观察叶片药害情况。

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