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龙图腾网恭喜合肥工业大学申请的专利一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115558702B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-04-22发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211025950.0，技术领域涉及：C12Q1/28；该发明授权一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法是由叶应旺;任玉伟;凌娜;邹艳艳;姚悦;曹璐璐;张丹凤;沈益忠设计研发完成，并于2022-08-25向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法在说明书摘要公布了：本发明涉及一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法，属于食品安全技术领域。本发明中双链探针是由适配体和目标DNA杂交而成，双链探针中的适配体与目标菌特异性结合，释放出目标DNA与发夹探针杂交，在核酸外切酶III的作用下，指数级扩增目标DNA。扩增的目标DNA置换出多壁碳纳米管复合材料上的催化探针，通过磁吸附碳纳米管复合材料后，上清液中掺氯化钾的木质素碳点催化过氧化氢生成羟基自由基，进而氧化无色的底物3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺形成蓝色产物，实现大肠杆菌O157:H7的可视化检测。本发明减小了样品基质干扰、成本低、催化特性稳定，通过核酸外切酶III辅助扩增技术搭配新型碳纳米酶，使可视检出限进一步提高至102cfumL，具有非常良好的推广前景。

本发明授权一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法在权利要求书中公布了：1.一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法，其特征在于，检测操作步骤如下：（1）制备待测液取1mL牛奶在5000×g条件下离心5min，弃去上清液，用1mL浓度0.1M、pH值7.4的无菌PBS缓冲液重悬沉淀，获得待测液；（2）扩增（2.1）在50μL双链探针溶液中加入200μL的待测液，在37℃条件下，孵育60min，在5000×g条件下离心5min，取上清液，即得复合溶液；所述双链探针是由适配体和目标DNA杂交制成；所述适配体的DNA序列为5′-CCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3′；所述目标DNA的DNA序列为5′-GGCAAGGCATAAGCGTCCGGAAAAAA-3′；（2.2）在60μL复合溶液中加入50μL浓度200nM退火发夹探针溶液，再加入0.45μL浓度200UμL的核酸外切酶III溶液和20μL的10×酶切缓冲液，加超纯水至终体积为200μL；在37℃条件下孵育75min，在70℃条件下加热20min，冷却至室温，获得扩增溶液；所述退火发夹探针为3′末端为单链游离端的茎环结构，所述退火发夹探针的DNA序列为5′-GGCAAGGCATAAGCGTCCGGAAAAAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATGCCTTGCC-3′；所述退火发夹探针中的茎环结构的DNA序列为5′-GGCAAGGCATAAGCGTCCGGAAAAAACCGGACGCTTATGCCTTGCC-3′；所述退火发夹探针中的3′末端单链游离的DNA序列为5′-ATGCCTTGCC-3′；（3）检测（3.1）在200μL扩增溶液中加入200μL多壁碳纳米管复合探针溶液，在37℃条件下，孵育50min，获得偶联物混合液；所述多壁碳纳米管复合探针由多壁碳纳米管化学偶联催化探针制成；所述催化探针由氨基化cDNA修饰的掺氯化钾的木质素碳点制成；所述cDNA的DNA序列为5′-TTTTCCGGACGCTTATGCCTT-CH26-NH2-3′；步骤（3.1）中，所述多壁碳纳米管复合探针溶液的制备操作步骤如下：（1）将2mg羧基化多壁碳纳米管加入到2mL浓度21.325gL、pH值5的吗啉乙磺酸一水合物溶液中，获得多壁碳纳米管溶液；（2）在2mL多壁碳纳米管溶液中加入2mgN-羟基琥珀酰亚胺和2mg1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在25℃条件下，孵育110min，获得活化的多壁碳纳米管溶液；（3）在2mL活化的多壁碳纳米管溶液中加入6mg羰基铁粉，在25℃条件下，孵育60min，获得多壁碳纳米管复合溶液；（4）在200μL多壁碳纳米管复合溶液中加入2μL浓度7μM的催化探针溶液，在37℃条件下孵育60min，获得催化探针混合溶液；（5）将202μL的催化探针混合溶液置于磁力架上静置1min，弃去上清液，加入200μL去离子水，重复上述操作两次，将沉淀重悬于200μL去离子水中，得到多壁碳纳米管复合探针溶液；所述催化探针溶液的制备操作步骤如下：（1）在5mL掺氯化钾的木质素碳点溶液中加入5mgN-羟基琥珀酰亚胺和5mg1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在室温下避光孵育30min，获得活化的掺氯化钾的木质素碳点溶液；（2）取上述活化的掺氯化钾的木质素碳点溶液，用浓度10mgmL的氢氧化钠溶液调节pH值至7.4，加入10μL浓度100μM的氨基化cDNA溶液，在室温下悬浮2h，获得催化探针溶液；所述掺氯化钾的木质素碳点溶液的制备操作步骤如下：（1）将0.1g的氯化钾和0.1g的木质素磺酸钠混合均匀，加入20mL去离子水充分搅拌均匀，获得预处理溶液；（2）将预处理溶液在180℃条件下反应12h，获得黑色溶液；（3）将黑色溶液在6500×g条件下离心10min，吸取上清液；用孔径0.22μm的滤膜过滤，获得掺氯化钾的木质素碳点溶液；（3.2）将400μL偶联物混合液置于磁力架上静置1min，取上清液作为催化复合溶液；（3.3）在催化复合溶液中加入50μL浓度100mM的过氧化氢（H2O2）溶液，再加入50μL浓度4.8gL的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）溶液，在25℃条件下避光反应15min，获得反应溶液；（4）检测结果的判定观察反应溶液的颜色变化，当反应溶液无色透明时，检测结果为阴性；当反应溶液为蓝色时，检测结果为阳性；取200μL阳性反应溶液放入到比色皿中，通过紫外分光光度计测定比色皿中反应溶液在654nm处呈现峰值的吸光强度；将654nm处的吸光强度值带入到检测方程中，计算得出待测液中的大肠杆菌O157:H7浓度，即完成检测。

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