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申请/专利权人：源道隆（苏州）医学科技有限公司

摘要：本发明涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，实施蛋白质包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段；还涉及使用该蛋白质制备的检测试剂盒。通过本发明的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本发明的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80％的阴性患者都死亡，可见本发明的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。

主权项：一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽段。

全文数据：一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用技术领域[0001]本发明涉及SFTS治疗和诊断领域，更特别地，涉及一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质及其应用，还涉及包含该蛋白质的ELISA检测试剂盒。背景技术[0002]自2004年以来，我国多地发生了一系列发热伴出血、白细胞减少及血小板减少、多脏器受损的病例。患者多来自华中山区，农业区，流行时间为每年的4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合，病例都有明确的蜱虫叮咬里是，其发病死亡率为12%_30%。该病的其他症状有胃肠不适、纳差厌食、恶心、腹泻、疲劳乏力、相对缓脉等，实验室检查发现白细胞减少和酶学改变等，其中，丙氨酸转氨酶（alaninetransaminase，ALT、谷草转氨酶aspartateaminotransferase，AST和肌酸激酶（creatinekinase，CK均有升高。所述症状与感染嗜中性粒细胞无形体anaplasmaphagocytophilum的患者相似，但经国家疾控中心相关研究证实，该病病原体是一种新的布尼亚病毒，又称发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（severefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus，sftsv，属于布尼亚病毒科龄'热病毒属的一种新病毒。[0003]与其它布尼亚病毒科白龄·热病毒属病毒类似，sftsV是一种球形、有包膜的负链RNA病毒，直径90-100nm，基因组RNA分为大（L、中⑻、小（s3个节段。L节段碱基长度是6368bp，其中包含2084个氨基酸的编码框;M节段碱基长度为3378bp，其中编码两种糖蛋白Gn、Gc的前体;S节段长为1744bp，编码核蛋白（Nucleocapsidprotein，NP和非结构蛋白NSs蛋白。[0004]可用于新布尼亚病毒检测或确认的方法有病毒分离、免疫荧光检测immunofluorescenceassay，IFA、酉每耳关免疫吸附检测（enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA、微量中和检测（microneutralizationtest，MNT及分子生物学方法reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT—PCR〇[0005]基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是该方法操作复杂，依赖贵重仪器，不便于区县医院推广检测，另外RT-PCR只能说明病毒存在体内感染，不能说明病毒在体内复制状态以及既往感染水平和疫苗的保护作用。[0006]ELISA方法操作简便，不依赖贵重仪器，目前的ELISA主要是检测病毒的NP抗原以及针对NP的抗体，由于NP抗原为病毒核衣壳抗原，因此针对NP抗原的ELISA检测试剂盒确实能够给PCR检测提供印证病毒感染的方法，但不能提供体内保护抗体的水平；由于NP蛋白为核衣壳蛋白，不直接参与病毒吸附侵入感染细胞的过程，针对NP的抗体不能阻止病毒感染机体，因此检测针对NP的抗体ELISA试剂盒只能反应体内免疫系统对病毒的抗体反应，不能直接反应保护抗体的水平。发明内容[0007]发明人在研究过程中发现，针对GN包膜蛋白的抗体能阻止SFTSV感染细胞，具有中和活性。故推测，检测针对GN抗体的ELISA试剂盒将能显示体内保护抗体的水平，能更好的辅助临床诊断和治疗SFTSV病毒感染。为证实上述假设，发明人从GN蛋白中截取一段，用来检测患者血液样品中的GN抗体情况，并观察患者的病程发展情况。出乎意料地，发明人发现，检测结果与患者的生死密切相关，检测结果为阳性的SFTS感染者全部存活，而80%的阴性SFTS感染者死亡。[0008]基于以上发现，本发明提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其包含氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的肽段。[0009]在一个优选实施方案中，所述肽段的C端连接有标签。标签的加入可在制备中有利于纯化，也可在检测过程中起鉴别作用。[0010]在一个实施方案中，所述标签肽为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。[0011]本发明还提供了表达上述蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。[0012]在一个实施方案中，所述核酸中编码SEQIDNO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。[0013]在一个实施方案中，所述表达载体的5’端还连接有编码IL2信号肽的核苷酸序列。通过添加IL2信号肽，可促进该蛋白质的分泌。[0014]本发明还提供了上述蛋白质在制备诊断SFTS感染者预后情况的试剂中的应用。[0015]本发明还提供了一种用于诊断SFTS患者预后情况的试剂盒，其中包括上述的蛋白质，以及检测所述蛋白质的抗体。[0016]在一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含两种所述蛋白质，分别为捕获用蛋白质和检测用蛋白质，所述检测用蛋白质上具有所述捕获用蛋白质上没有的标签。捕获用蛋白质可捕获样品中的抗SFTSV抗体，检测用蛋白质可特异性结合捕获的抗SFTSV抗体，并且检测用蛋白质上的标签可用于显示该检测用蛋白质的存在与否，从而体现样品中是否存在抗SFTSV抗体。[0017]在一个具体实施方案中，所述试剂盒包括以下试剂：[0018]1包被了所述捕获用蛋白质的固体基质，例如，可为包被O.l-lOygmlsGN-his蛋白（即，C端加多聚组氨酸标签于96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板；[0019]2封闭液，例如，可为含有5%脱脂奶粉的PBST;[0020]3包含所述检测用蛋白质的溶液，例如，可为用封闭液稀释的工作浓度为0.1-10μgmlsGN-rFc蛋白（即，C端加兔Fe标签），也可是焚光标记的sGN;[0021]4显示用试剂组，显示用试剂组用根据检测用蛋白质上的标签来设计。例如，当蛋白质为sGN-rFc时，显示用试剂组可包括偶联了HRP的羊抗兔二抗以及TMB显色底物。[0022]通过本发明的蛋白质及试剂盒，可检测SFTS患者体内是否存在保护性抗体，判断该患者的预后情况。当本发明的试剂盒检测为阳性时，患者预后良好，都能存活，当检测结果为阴性时，患者预后不良，80%的阴性患者都死亡，可见本发明的试剂盒具有对SFTS患者具有可靠的预后判断能力。检测结果呈阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，呈阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。附图说明[0023]图1为pFuse-sGN-his的质粒图；[0024]图2为pVAXl-sGN-rFc的质粒图；[0025]图3为SDS-PAGE检测纯化的sGN-his和sGN-rFc蛋白的电泳照片；[0026]图4为WB检测人血清和GN蛋白结合反应的电泳照片，1-10是康复期病人Ptl-10;12-15是死亡病人?丨12-15;吧、财、价1是健康人，]\1为蛋白11^迚6〇[0027]图5为ELISA检测人血清样品的㈤的统计图。具体实施方式[0028]以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0029]从NCBI网站获取HB29SFTSV的GN蛋白序列和基因序列信息，进行序列分析，选取不同区段进行优化表达以及表达纯化实验，根据表达实验和免疫实验的结果，发明人出乎意料地发现，当用SEQIDN0:1所示氨基酸序列进行检测时，显示检测成阳性的患者预后良好，反之，检测结果呈阴性的患者预后不良，百分之八十的阴性患者均死亡，可见，该肽段与预后具有强烈的相关性。基于以上研究成果，本实施例提供的方案如下。[0030]1.抗原肽Gn的表达和纯化[0031]在SEQIDNO:1对应的核酸序列SEQIDNO:2的基础上进行人类密码子优化，得到SEQIDNO:3,以更利于人肾上皮细胞系293F的表达，此外，在SEQIDNO:3的N端连接IL2信号肽（S卩，在5’端连接IL2信号肽的编码序列）以促进蛋白的分泌。并在C端连接6个组氨酸作为His-tag即，在3’端连接6个组氨酸的编码序列，最终得到的融合蛋白在本文中称为sGN-his，或在C端连接兔FcS卩，在3’端连接兔Fc的编码序列，得到的融合蛋白在本文中称为sGN-rFc。将以上核酸序列分别克隆岛真核表达载体pVAn中，得到sGN-his的表达载体图1和sGN-rFc的表达载体（图2。将上述两个表达载体分别转入293F悬浮细胞中，分别表达sGN_his和sGN-rFc。[0032]收集细胞转染上清，通过Ni+NTA柱纯化sGN-his，ProteinA纯化sGN-rFc，获得两种蛋白。SDS-PAGE检测蛋白分子量和纯度。如图2所示，sGN-his和sGN-rFc蛋白条带大小和预期的一致，纯度大于90%，表明sGN-his和sGN-rFc蛋白表达成功。[0033]2.Westernblot检测病人血清与sGN-his蛋白的反应[0034]10%的SDS-PAGE胶用来分离sGN-his蛋白，通过湿转法将蛋白电转到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，将不同的病人血清以及健康人血清均以5%脱脂牛奶1:300稀释，4°C孵育过夜，PBST洗涤3次。goat-anti-human-HRP二抗以5%脱脂牛奶稀释，终浓度为1:4万，室温孵育lh，PBST洗膜5次，ECL显示，暗室曝光。结果如表1和图4所示，健康人血清不与sGN-his蛋白结合，死亡病人血清均不与sGN-his蛋白结合，康复期的病人血清有910与sGN-his蛋白结合;这些结果提示，WB阳性的SFTS病人，存活率为99泳道1-8和10，100%，WB阴性的SFTS病人存活率为15泳道9，20%，死亡率为45泳道12-15，80%。[0035]由此可见，该抗原肽的检测结果与SFTS患者的存活和死亡强烈相关。[0036]表1健康者和不同患者的WB血清结合总览[0037][0038]3.ELISA试剂盒[0039]针对该抗原肽的检测特性，设计出ELISA试剂盒，以利于临床检测。该试剂盒包括：[0040]IGN-his蛋白包被的96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板；[0041]⑵封闭液:5%脱脂奶粉溶于PBST，[0042]3检测用蛋白：封闭液稀释的工作浓度为0.lugml〜10ugmlsGN-rFc蛋白；[0043]4显不齐丨J，包括：二抗：Goat-anti-rabbit_HRP的二抗（Jacksonimmuneresearch公司，711-035-152和TMB底物BiopandaCatN0.TMB-S-003。[0044]其中，GN-his蛋白包被的96孔酶免透明聚苯乙烯微孔板可通过以下方法制备：用包被液稀释sGN-his蛋白，至终浓度为0.1-10ygml，每孔150-200μ1加入酶标板中，4°C过夜。[0045]4.ELISA试剂盒的使用方法[0046]本试剂盒于2_8°C保存，有效期6个月。使用前将试剂盒平衡至室温约30分钟）。未用完的微孔板条须与干燥剂及其自封袋密封2-8°C保存。实验前将液体试剂轻轻震荡混匀，使用后立即密闭放回2_8°C保存。在实验过程中设立空白对照，S卩，没有包被sGN-his蛋白的微孔，具体检测方法如下：[0047]Sl:洗板，以洗涤缓冲液I3BST洗涤3遍，PBST150-200μ1孔，5min次，甩干孔中洗涤液并于无尘吸水纸上扣拍两下将包被sGN-his蛋白的微孔板条平衡至室温，洗液洗板3次；[0048]S2:封闭，封闭液150-200μ1孔，37°C封闭1小时，洗液洗板3次；[0049]S3:上样，病人及健康人血清用封闭液以1:1，1:5倍两个梯度稀释，预先在八连排中稀释，之后20μ1孔加入到封闭好的孔中，置于37°C1.5小时，上样完毕洗涤3遍；[0050]S4:检测用蛋白孵育，洗板后添加20μ1终浓度为500ngAil的SGN-rFc蛋白，37°C孵育1.5小时，上样完毕洗涤3遍；[0051]S5:显示，洗液洗板3次，添加用封闭液稀释的Goat-anti-rabbit-HRP的二抗37°C孵育1小时，洗板后添加TMB底物显色，10分钟后用IMH2SO4进行终止；[0052]S6::读板，于酶标仪上波长450nm处读取㈤值，并保存数据。[0053]结果判断：[0054]复孔差异应小于10%。[0055]阳性对照，阴性对照正常。[0056]将读取的㈤值作如下计算：[0057]PN=实验值-空白对照八阴性对照-空白对照）[0058]当PN值彡2.1时，同时㈤值0.2时，表明实验组为阳性，反之则为阴性。[0059]ELISA检测结果显示10位SFTS康复期血清里，8位显示阳性，2位显示阴性;4位死亡SFTS病人的血清里均不含有针对GN蛋白的抗体;作为阴性对照，29位健康人的血清均没检出针对GN蛋白的抗体，说明该试剂盒假阳性率为0%，具有极好的特异性检测（图5。结果显示，ELISA试剂盒的检测结果与WB检测人血清与sGN-his蛋白的结合基本一致（表2。即ELISA和WB阳性的SFTS病人，存活率均为100%，WB阴性的SFTS病人死亡率为45,80%，ELISA检测阴性的SFTS病人死亡率，46，66.7%。因此该试剂盒对SFTS病人血清阳性和阴性的结果对于辅助治疗SFTS感染具有十分重要的临床价值;实验结果提示对于ELISA阳性的SFTS病人可以采取保守治疗，对于ELISA阴性的SFTS病人，应采取应急治疗。[0060]表2ELISA试剂盒检测结果总览[0061][0062][0063]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种用于诊断SFTS患者预后情况的蛋白质，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的肽段。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述肽段的C端连接有标签。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述标签肽为多聚组氨酸标签、兔Fc或荧光标记。4.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质的表达载体，其特征在于，包含编码所述蛋白质的核酸，以及位于所述核酸序列上游的启动子。5.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述核酸中编码SEQIDNO:1所示的肽段的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的5’端还连接有编码IL2信号肽的核苷酸序列。7.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质在制备诊断SFTS感染者预后情况的试剂中的应用。8.—种用于诊断SFTS患者预后情况的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，以及检测所述蛋白质的抗体。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含两种所述蛋白质，分别为捕获用蛋白质和检测用蛋白质，所述检测用蛋白质上具有所述捕获用蛋白质上没有的标签。10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，包含以下试剂：1包被了所述捕获用蛋白质的固体基质；2封闭液；3含有所述检测用蛋白质的溶液；4显示用试剂组。

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