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申请/专利权人：华南农业大学

摘要：本发明公开一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6的应用，涉及植物基因工程和生物技术领域。本发明通过实时荧光定量PCR方法，在大豆中鉴定了一个菌根诱导表达的蔗糖转运蛋白基因GmSWEET6，该基因的表达受菌根真菌侵染的调控。菌根真菌接种条件下，转基因大豆植株中超量或干涉表达GmSWEET6具有调控植物生长和磷吸收，对大豆与丛枝菌根真菌的有益共生具有显著的影响，这对阐明SWEET基因在豆科作物与菌根真菌共生中的生物学功能，从而调控植物与菌根真菌之间的有益共生有着重要意义。

主权项：1.大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在菌根共生方面的应用。

全文数据：大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6的应用技术领域[0001]本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6的应用。背景技术[0002]高等植物是由自养器官和异养器官构成的自养生物。异养器官需要自养器官的光合产物来维持生长和发育。植物成熟叶片等“源”器官中合成的光合同化物80%都经过植物维管系统运输到根、花、果实等“库”器官。蔗糖是绿色植物光合同化物之一，也是绝大多数高等植物体内光合产物运输与分配的主要形式杨双等，2005;白雪梅等，2006。蔗糖在植株中定向运输和分配的方式不仅调控植株的整个生长和发育进程，也决定作物的产量和品质。SWEETSugarsWillEventuallybeExportedTransporters作为一种新的糖转运蛋白，具有蔗糖和单糖外排的功能，这可能是蔗糖从韧皮部卸载到根等库器官的关键所在。已有大量研究表明，SWEET基因参与多种生理过程，包括韧皮部装载、影响生殖发育、参与宿主-病原体互作的抗病反应和胁迫反应以及离子转运等。已经报道的与根瘤菌共生相关的MtSWEETl1;土豆中的12个StSWEETs基因在接种丛枝菌根真菌后上调表达，这表明SWEET转运蛋白可能参与蔗糖向共生界面外排糖的过程。[0003]在4亿5千万年前，丛枝菌根真菌ArbuscularMycorrhizaFungi，AMF与植物形成了共生关系Wangetal.,2006。现在，有大约80%以上的陆生植物可以与AM真菌形成共生系统Smithetal.，2008JM真菌的孢子在土壤中萌发，菌丝侵入植物根系至皮层细胞中，然后形成丛枝结构。AM真菌发达的根外菌丝可以到达植物根系所不能接触的区域吸收营养物质尤其是磷），并通过共生系统的菌根途径传递给植物，从而提高寄主的养分效率。不仅如此，共生系统的形成还可以有效缓解铝、锰等重金属毒害，提高植物抵御非生物胁迫的能力。作为回报，植物体为AM真菌提供碳源，包括糖类，供真菌丛枝、菌丝、孢子以及泡囊等基本结构的生长发育和生命周期的正常进行Varmaetal.，1995;Readetal.，1997。因此，在共生系统中，蔗糖转运蛋白也必然发挥着至关重要的作用。[0004]大豆，是我国重要的粮油作物。世界各国栽培的大豆都是直接或间接由我国传播出去的（何进尚，2009。目前在大豆中共鉴定了53个GmSWEETs基因家族成员（Patiletal.，2015。到目前为止，在菌根植物中，还没有找到负责将蔗糖外排到共生界面的，菌根诱导SWEET转运蛋白，而且在大豆中还没有关于菌根诱导的SWEET转运蛋白的相关研究。发明内容[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6的应用。[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现：[0007]本发明提供一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在菌根共生方面的应用。[0008]所述的大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6的核苷酸序列为Glyma.04G198600所示，GmSWEET6基因编码的蛋白质的氨基酸序列为Glyma.04G198600所示。[0009]本发明通过实时荧光定量PCR方法，在大豆中鉴定了一个菌根诱导表达的蔗糖转运蛋白基因GmSWEET6,该基因的表达受菌根真菌侵染的调控。菌根真菌接种条件下，转基因大豆植株中超量或干涉表达GmSWEET6具有调控植物生长和磷吸收，对调控植物与菌根真菌之间的有益共生具有重要意义。[0010]本发明还提供一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在植物育种中的应用，进一步的，在培育转基因植物中的应用。[0011]所述的植物为双子叶豆科植物。[0012]所述的双子叶豆科植物为大豆。[0013]本发明提供的基因GmSWEET6和蛋白能够调控包含它的转基因植株的生长和磷吸收。[0014]扩增上述GmSWEET6基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。[0015]本发明还提供含有上述GmSWEET6基因的重组表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmSWEET6基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如PTFlOl·IWangetal·,2009或其它衍生植物表达载体。[0016]本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的重组表达载体。[0017]本发明还涉及细胞，其包含本发明的GmSWEET6基因或重组表达载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。[0018]本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如菜豆和大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。[0019]本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括:从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。[0020]本发明还涉及本发明的方法生产的植物。[0021]本发明还提供一种大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在调控植物与菌根真菌有益共生关系形成中的应用;进一步的，在制备调控植物与菌根真菌共生制剂中的应用。[0022]所述的植物为双子叶豆科植物。[0023]所述的双子叶豆科植物为大豆。[0024]本发明还涉及本发明的GmSWEET6基因或重组载体在调控植物与菌根真菌有益共生关系形成中的用途，包括制备转基因植物以及制备改变植物与菌根真菌形成有益共生关系的制剂。[0025]本发明还涉及调控植物与菌根真菌形成有益共生关系的方法，该方法包括制备含有本发明的GmSWEET6基因或重组载体的植物。例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。[0026]本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因GmSWEET6导入大豆下胚轴注射诱导的根系中，得到转基因株系;所述转基因株系的生长，包括生物量和磷含量发生明显变化。[0027]所述基因GmSWEET6可以是通过所述重组表达载体导入受体大豆下胚轴根系。[0028]携带有本发明的基因GmSWEET6的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到大豆下胚轴根系中。[0029]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：[0030]基因GmSWEET6所属的SWEET基因家族在拟南芥和苜蓿等虽已被克隆及报道，但其在豆科作物与丛枝菌根真菌有益共生方面的生物学功能并不清楚。本发明的基因GmSWEET6对大豆与丛枝菌根真菌的有益共生具有显著的影响，这对阐明SWEET基因在豆科作物与菌根真菌共生中的生物学功能，从而调控植物与菌根真菌之间的有益共生有着重要意义。附图说明[0031]图1是GmSWEETs家族基因在根部对AM真菌侵染的反应;植株采用砂土培实验，选用两种不同的大豆基因型BD2和BX10,在低磷（LP，50yMKH2PO4或者高磷（ΗΡ，500μΜKH2PO4处理条件下，不接种（NM或者接种丛枝菌根真菌Ri45d后收获。Ri:Rhizophagusirregularisaa-hiGmSWEETs基因在根部的表达量；图中的数据为四次生物重复的平均值土SE。星号*表示同一基因型和同一磷处理下，植株接菌与不接菌之间差异显著。[0032]图2是GmSWEET6启动子驱动的GUS表达与菌根结构的共定位分析；其中，图2a为GmSWEET6启动子驱动⑶S的表达情况，图2b为经WGA488染色后菌根结构的荧光情况。[0033]图3是GmSWEET6的亚细胞定位分析；图中第一排为转化空载体的烟草表皮细胞，紧接着是转化GFP-GmSWEET6载体的烟草细胞，图为在共聚焦显微镜下观察拍摄GFP和膜定位MarkermCherry的焚光共定位。[0034]图4是过量和干涉表达GmSWEET6转基因植株的表达量检测。采用下胚轴注射方法，将过表达载体GmSWEET6-0X-pTF101.Is和干涉载体GmSWEET6-pFGC5941转入磷高效品种YC03-3中，在低磷（50μΜKH2P〇4的条件下，不接种NM或接种丛枝菌Ri处理。a，b为地上部的基因表达量数据;c，d为根部数据。其中，CKl表示转入pTFlOl.Is空载的对照;6-0X表示过量表达GmSWEET6转基因植株;CK2表示转入pFGC5941空载的对照；6-RNAi表示干涉表达GmSWEET6转基因植株。图中数据是五次生物学重复的平均值和标准误。*表示同一接菌处理下不同转基因株系间差异显著P〈〇.05。[0035]图5是过量和干涉表达GmSWEET6对大豆转基因植株磷含量a，b和植株生长情况c，d的影响。采用下胚轴注射方法，将过表达载体GmSWEET6-0X-pTF101.Is和干涉载体GmSWEET6-pFGC5941转入磷高效品种YC03-3中，在低磷50μΜKH2P〇4的条件下，不接种NM或接种丛枝菌（Ri处理。a，b为根部磷含量；c，d为根部生物量。其中，CKl表示转入pTFlOl.ls空载的对照；6-0X表示过量表达GmSWEET6转基因植株;CK2表示转入pFGC5941空载的对照;6-RNAi表示干涉表达GmSWEET6转基因植株。图中数据是五次生物学重复的平均值和标准误。*表示同一接菌处理下不同转基因株系间差异显著P〈〇.05。具体实施方式[0036]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。[0037]下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。[0038]实施例1[0039]GmSWEETs基因家族在大豆根系中的表达模式分析：大豆SWEET基因家族共有53个成员（Patiletal.，2015，根据进化上的同源关系，筛选与蔗糖转运和微生物共生相关的第三支28个成员作为候选基因，然后通过定量PCR技术，确定GmSWEETs家族成员基因在不同大豆品种、不同接菌处理以及不同磷水平下的表达情况。[0040]采用2个大豆品种，磷高效巴西10BXlO和磷低效的本地2BD2，设置2个AMF接种处理分别为不接种NM和接种AM真菌RhizophagusirregularisRi。设置两个磷处理，50μΜKH2PO4作为低磷LP和500μΜKH2PO4作为高磷HP，低磷处理的K+用K2S〇4补齐。采用12Hoagland营养液砂土培种植。选用2kg规格的红色塑料圆盆，每盆装入石英砂1.6kg，酸性土0.2kg，砂土经121°C高压灭菌40min，循环两次。装盆时加入相应AMF菌剂或-AMF模拟接种物0.2kg10%，完全混匀后用150mL相应营养液润湿，大豆种子用氯气干热灭菌的方法灭菌，每盆点播3粒种子，然后每盆再补IOOmL相对应的营养液。出苗1周后间苗，每盆保留1株。每周浇相应LPHP的l2Hoagland营养液一次。每个处理设置4个生物学重复。常规管理，7周后收获，提取地上部和根部RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmSWEETs的表达模式。大豆的看家基因EF-Ia作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：[0041]大豆EF-Ia基因的引物为：[0042]EF-IaF：57-TGAACCACCCTGGTCAGATT-37SEQIDN0:1[0043]EF-IaR：S^TCCAGCATCACCATTCTTCA-S7SEQIDNO:2[0044]GmSWEET6基因的引物为：[0045]GmSWEET6F：57-CGTTCGGGAGCGTAACATAG-37SEQIDNO:3[0046]GmSffEETeRiS7-TCGGACCAAAAGCGTAGAGT-S7SEQIDNO:4[0047]其他GmSWEETs基因定量引物序列见Patil等2015的论文。[0048]qPCR反应体系：10yLPowerUp™SYBRk5GreenMasterMix?0.6uLPrimerR，0.6uLPrimerF，2uLcDNA，ddH2〇Upto20uL〇[0049]其中cDNA稀释20倍后用于实验，从每个不同的实验处理中随机取cDNA原液，制作标曲，保证每一种处理至少有一个用来混标曲，标曲成梯度稀释5倍。[0050]PCR反应条件为95°C变性1分钟，然后95°C变性15秒，60°C退火并延伸60秒，进行40次循环。[0051]数据分析:在ABIStepOnePlusbiosystems中选定适合的阈值使得标准曲线的R2尽量达到1，E值在85%〜110%之间，ABIStepOnePlusbiosystems软件根据标准曲线自动计算目的基因和内参基因的CT值而得到一个表达量，目的基因的浓度与内参基因的表达量的比值即为目的基因的相对表达量。为了保证实验结果的准确性，每个处理至少设置4个生物学重复，确保反应趋势一致。结果如图1所示（图中未列出的基因为受低磷和或菌根诱导均不表达）。[0052]结果表明:GmSWEET6受菌根强烈诱导表达，尤其是在低磷条件下。[0053]结果暗示GmSWEET6可能在植物与菌根真菌的有益共生关系中起重要作用。[0054]实施例2[0055]l、GmSWEET6基因的克隆：以大豆YC03-3叶部cDNA为模版，用上游特异引物5'-ATCGCCCGGGATGTCGTCCCACAGTCATCTAA-37SEQIDNO:5和下游特异引物5'-ATCGCCCCGGGTCAAACTTCGCAACTGATCACCC-37SEQIDNO:6扩增GmSWEET6基因的ORF全长序列864bp，并测序比对，获得GmSWEET6编码序列见Glyma.04G198600，对应的蛋白序列见Glyma.04G198600。[0056]2、GmSWEET6基因启动子克隆、载体构建及组织表达定位分析：启动子分析表达载体的构建:按照常规方法，提取大豆YC03-3基因型的叶片基因组DNA，以大豆叶部基因组DNA为模板，用上游特异引物5Z-CTATGACATGATTACGAATTCCCACCTTGTTATACCTCATT-3'SEQIDNO:7和下游特异引物5'-GACTGACCTACCCGGGGATCCGGAATTTCTCTCTCTCTCTCT-37SEQIDN0:8扩增GmSWEET6启动子2176bp片段，PCR片段回收后，通过EcoRI和BamHI对目的载体进行双酶切后，将GmSWEET6启动子基因通过一步克隆的方法连接到目的载体pTF102。转化大肠杆菌DH10B，测序无误后转化根癌农杆菌EHAlOl，用于根癌农杆菌介导的大豆子叶节整株转化（Wangetal·，2009。[0057]对于GmSWEET6组织表达定位分析，采用砂培试验，选用启动子整株转化株系proGmSWEET6，供试根丛枝菌根真菌为Ri，低磷50μΜKH2PO4营养液。低磷处理的K+用K2SO4补齐。设置10个生物学重复。常规管理，开花期收取新鲜根部样品，洗净，进行GUS活性染色。然后将染成蓝色的根剪成小根段，用低熔点琼脂包埋后纵切，用WGA488对AM真菌的侵染结构进行染色，然后用荧光显微镜分别在明场和488nm波长处观察拍照。结果见图2。结果表明：GmSWEET6在菌根的丛枝结构中被诱导表达。[0058]实施例3[0059]亚细胞定位实验载体的构建：以大豆YC03-3叶部cDNA为模版，用上游特异引物5~GGGGacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGTCGTCCCACAGTCATCTAA-3'SEQIDN0:9和下游特异引物5-GGGGaccactttgtacaagaaagctgggtcTCAAACTTCGCAACTGATCACCC-3SEQIDN0:10扩增GmSWEET6基因的ORF全长序列864bp，PCR回收片段，通过Gatway技术将GmSWEET6基因连接到目的载体PMDC43。转化大肠杆菌DH10B，测序无误后转化农杆菌GV3101，用于进行亚细胞定位实验。[0060]对于GmSWEET6的亚细胞定位分析，采用烟草表皮细胞瞬时转化的方法。先将融合有GmSWEET6基因的GV3101菌液以及转入膜Marker质粒1008的GV3101菌液摇菌过夜，然后离心，用包含有IOmMMES、10mMMgCl2和150μΜAS的重悬液重悬菌液。22〜24°C暗培养3〜4h，将二者等体积混合后，转化至3〜4周龄的烟草叶片中，转化3天后，在激光共聚焦488nmGFP和587nmmCherry处观察荧光。实验结果见图3。结果表明:GmSWEET6定位在质膜和核膜上。[0061]实施例4[0062]1、过量表达GmSWEET6载体的构建：以大豆YC03-3基因型的叶部cDNA为模板，用上游特异引物5'-GCGAGCTCGGTACCCGGGATGTCGTCCCACAGTCATCTAA-3'SEQIDNO:11和下游特异引物5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTCAAACTTCGCAACTGATCACCC-37SEQIDNO:12扩增GmSWEET6基因的ORF全长序列864bp，PCR回收片段后，通过SmaI对目的载体进行酶切，将GmSWEET6基因连接到目的载体pTFlOl.ls，得到过表达载体GmSWEET6-0X-pTF101.Is。转化大肠杆菌DH10B，测序无误后转化发根农杆菌K599,用于发根农杆菌介导的大豆下胚轴注射转化Lietal.,2014。[0063]2、干涉GmSWEET6载体的构建：以大豆YC03-3基因型的叶部cDNA为模板，用上游特异引物5'-TTACCATGGGGCGCGCCGATATCTATGTTACGCTCCCGA-3'SEQIDNO:13和下游特异引物5'-CATCGATTGGGCGCGCCAACTTCGCAACTGATCACCCTTTC-3'SEQIDNO:14扩增390bp特异目的片段，使用AscI对目的载体进行酶切后，用一步克隆的方法将GmSWEET6基因正向片段连接到目的载体PFGC5941。然后再用上游特异引物5'-GCAGGTATTTGGATCCAACTTCGCAACTGATCACCCTTTC-37SEQIDNO:15和下游特异引物5'-GACTCACCTAGGATCCGATATCTATGTTACGCTCCCGA-37SEQIDNO:16扩增反向片段，使用BamHI对目的载体进行酶切后，用一步克隆的方法将反向片段连接到包含有正向片段的目的载体PFGC5941中，得到干涉载体GmSWEET6-pFGC5941，转化大肠杆菌DHlOB，测序无误后转化发根农杆菌K599,用于发根农杆菌介导的大豆下胚轴注射转化Lietal.,2014。[0064]3、大豆转基因植株的获得:将构建好的过量以及干涉GmSWEET6表达载体质粒转化至发根农杆菌中，采用发根农杆菌介导的大豆下胚轴注射转化获得转基因嵌合植株Lietal.，2014，后续的表型鉴定均使用转基因嵌合株系。[0065]4、大豆转基因植株的检测[0066]过量或干涉GmSWEET6下胚轴注射转化材料的检测:剪取部分单株下胚轴伤口处长出的不定根提取RNA并反转为cDNA作为模板，质粒DNA作为阳性对照，非转基因大豆的根系cDNA作为阴性对照，用上游特异引物5-CAACCACTACATCGAGACAAGCA-3SEQIDN0:17和下游特异引物5-TCATCAGATCTCGGTGACGGG-3SEQIDN0:18扩增除草剂抗性基因（Bar基因）片段进行PCR检测。此外，进一步用定量PCR检测过量或干涉的效果，定量PCR试验中以大豆看家基因如上所述EF-Ia为参照基因（引物序列：SEQIDNO:1，2，相对表达量为目的基因GmSWEET6引物序列：SEQIDN0:3,4的表达量与看家基因表达量的比值。经过PCR检测及定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。结果见图4。[0067]5、过量或干涉GmSWEET6对大豆转基因植株磷含量的影响：收获接种丛枝菌根真菌45天的不同转基因株系并测定磷含量，包括:地上部磷含量和根部磷含量等。[0068]图5a，b为过量或干涉表达GmSWEET6对大豆转基因植株磷含量的影响。其中植株采用砂土培实验，在低磷50μΜKH2P〇4的条件下，不接种NM或接种丛枝菌Ri处理45天后收获，低磷处理的1+用12304补齐。结果显示：在接种Ri的情况下，与对照相比，过量表达GmSWEET6后，根部磷含量显著下降，而干涉GmSWEET6后，根部磷含量显著上升。[0069]6、过量或干涉表达GmSWEET6基因对大豆转基因植株生物量的影响：[0070]植株生物量测定：百分之一天平称量地上部和根部样品鲜重，所有样品在105°C烘箱杀青30分钟后置于75°C烘干至恒重，称取干重。[0071]图5c，d为过量或干涉表达GmSWEET6对大豆转基因植株生物量的影响。其中植株采用砂土培实验，在低磷50μΜKH2P〇4的条件下，不接种NM或接种丛枝菌Ri处理45天后收获，低磷处理的1+用12304补齐。结果显示：在接种Ri的情况下，与对照相比，过量表达GmSWEET6后，根部生物量显著下降，而干涉GmSWEET6后，根部生物量显著上升。表明，在植物与菌根共生过程的碳分配中，GmSWEET6可能发挥着至关重要的作用，可能通过调控寄主植物向菌根共生系统中的碳投入，影响植物对磷的菌根途径吸收，从而影响寄主植物生长。[0072]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在菌根共生方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在植物育种中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在培育转基因植物中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在调控植物与菌根真菌有益共生关系形成中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:大豆蔗糖转运蛋白重要基因GmSWEET6在制备调控植物与菌根真菌共生制剂中的应用。6.根据权利要求2〜4任一项所述的应用，其特征在于：所述的植物为双子叶豆科植物。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的双子叶豆科植物为大豆。

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