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申请/专利权人：深圳先进技术研究院

摘要：本发明提供了一种包含CPEB1基因负调控区域的慢病毒载体及其制备方法和应用。本发明构建的包含CPEB1基因负调控区域慢病毒载体或重组慢病毒具有很高的感染效率以及转录效率，能将插入的编码基因通过基因重组插入宿主基因组，从而使得宿主细胞持续、稳定地表达CPEB1。为研究microRNA‑122及其靶基因CPEB1在角膜移植排斥中的作用提供了一种十分简便的工具。

主权项：一种包含CPEB1基因负调控区域的慢病毒载体，其特征在于，所述包含CPEB1基因负调控区域的慢病毒载体为在pLVX‑IRES‑ZsGreen1慢病毒质粒的多克隆位点插入CPEB1编码基因序列及其3’UTR序列得到的重组质粒。

全文数据：一种包含CPEB1基因负调控区域的慢病毒载体、及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体及其制备方法和应用。背景技术[0002]胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（cytoplasmicpolyadenylationelementbindingprotein,CPEB是一种mRNA结合蛋白，在无脊椎动物和脊椎动物中均发挥着重要生物功能。有研究表明CPEBl的大量表达与角膜移植免疫排斥反应密切相关，而且CPEBl调控多种组织、器官的基因表达，并与多种疾病的发生发展有关。[0003]发明人课题组通过研究角膜移植术后免疫排斥反应相关的microRNA谱，发现角膜免疫排斥反应与miR-122及其靶基因CPEBl相关，但microRNA-122及其靶基因CPEBl如何在角膜移植排斥中起作用还不清楚。[0004]因此，需要提供一种能用于研究microRNA-122及其靶基因CPEBl在角膜移植排斥中的作用的方法。发明内容[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种包含CPEBl基因编码区及其3‘UTR调控区域以及microRNA-122结合位点突变的慢病毒载体和重组慢病毒及其应用，此外，本发明还提供了一种宿主细胞。[0006]第一方面，本发明提供了一种包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体，为在PLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒质粒的多克隆位点插入CPEBl编码基因序列及其3’UTR序列得到的重组质粒。[0007]优选地，所述CPEBl编码基因序列的NCBI登录号为ML030594。[0008]优选地，所述CPEBl编码基因序列的3’UTR序列为SEQUENCEIDNO:1所示的核苷酸序列。[0009]SEQUENCEIDNO:1:[0010]GATTCCAGCTAGAGGAGCTGGCCTTGCCCAGTGTCCTGTGGTGCCAAAGGCTGTCAAGTCAGGCAGCAACTCGCTGCACAGGCGCCATGGGAGCTAGCTTTGCGCAGACAAGGGAGAATCGTAGTCACCTTTGTACTTGCTAACTCTGTCTTTGTTTCTGCACTAATTAATGCACAATGAGTTTTGTCAGGTCTTGTTTTCAGTGGGGTGTGCCAGAGCAAGGACCCTCGGCTCACCCTCAAGCAATTGTAGTTTTCCCAGATTCTAGTTCCTCATTTTGCAAATGAAAATAACAACAACAACCACTGTGTCCAGAAGGTCTGACACAGATGCCTACACTTGGGTTTATTTATTAAAGCGCTTTTTACATTCCTTGCAATACTGATGGTGGTGATGCGCAGGTCTCATTGGTTCGTTCATTCTGCAGTTGCCATACAGTGCCTTTCCATTGATTTAACCCCCACCTGAACGGCATCAATTGAGTGTTCAGCTGGTGTTTTTTACTGTAACAAACAAAGGAGACTTTGCTCTTCATTTAAACCAAATCATATTTCATAGTTTACGCTCGAGGGTTTTTACTGGTTCCTTTTTACACTCCTTAAAACAGTTTTTAAGTCGTTTGGAACAATATATTTTTTTTTCTTTCTTGGCAGCTTTTAACATTATAGCAAATTTGTGTCTGGGGGACTGCTGGTCACAGTTGCAAATCAAAGCATTTGTAACCAAGAGAAAAATTATTTTATTTAAAACTGGACCGGAGGAAAAGTCTGAGCAGCTGCTGTATATAGTTTTAAATGGTTTGTGGCACCTTATGTTGCACTTATGTTGGGGGAGGGTTGATAGAAGTTTTTAATCACAGTCACAGGACTTTTTCTTTTGTAACTGAGCTTAAAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCTGCTTTTTGGTGGGGGCAGGTGAAGGCTCACAGGAGCCCTTTCTCTTAGAGGGGCAAATACCCTTCCTTACAACTTTTATTTGACGAATGTATGAATCAACAGTTACAGTTGACAAAGACGCTACTGGAATTGAAAACTTGACTTTTCTTTTTAATTTAACGATTACTTGCCTCTCTTAGGGAAGCTGTGTGCCAAAGAGCCAGTGTCATAACCCCTCCCTCCTGCTGAGCTGATGTTGCATTGTTGCATATCCCAGCTACTCTGTGGGTTTTGTGAAGCTGTGTGTGAAGTCTCTACCTCATTGTTGTATATGCAGGCAAGACTGCACTCTCCTACAGATGTGTGGAGTAAGCTGTGGTGTAATTTTTTTGGCACATAATAAACACGTTGCAGC[0011]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述PLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒质粒的ClaI位点。[0012]本发明构建的慢病毒载体具有很高的感染效率以及转录效率，插入的编码基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，从而使得宿主细胞持续、稳定地表达CPEB1。[0013]第二方面，本发明提供了一种重组慢病毒，是如第一方面所述的慢病毒重组表达载体转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。[0014]第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如第一方面所述的慢病毒重组表达载体或如第二方面所述的重组慢病毒。[0015]优选地，所述宿主细胞为角膜基质细胞。[0016]本发明采用高质量的病毒液感染宿主细胞;然后检测基因功能，并使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，得到具有长期的表达稳定性的细胞克隆株。本发明提供的所述细胞克隆株能够为一般的动物活体实验提供足够病毒液。[0017]第四方面，的本发明提供了一种试剂盒，包括如第一方面所述的包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体、第二方面所述的重组慢病毒、第三方面所述的宿主细胞中的一种或多种。[0018]本发明第一方面提供的包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体可用于对microRNA-122及其靶基因CPEBl在角膜移植排斥中的作用进行研究，本发明实施例表明：microRNA-122表达下调时（角膜移植排斥组），CPEBl表达呈上升趋势，导致角膜基质细胞凋亡产生增加，从而可能促进角膜移植术后免疫排斥反应。不难看出，可通过本发明第一方面提供的包含CPEB1基因负调控区域慢病毒载体对microRNA-122进行调节，进而调节CPEB1的表达，达到调节角膜移植术后免疫排斥反应发生的效果。[0019]本发明提供的包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体及其制备方法和应用具有如下有益效果：[0020]本发明构建的包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体或重组慢病毒具有很高的感染效率以及转录效率，能将插入的编码基因通过基因重组插入宿主基因组，从而使得宿主细胞持续、稳定地表达ERR。为研究microRNA-122及其靶基因CPEBl在角膜移植排斥中的作用提供了一种十分简便的工具。附图说明[0021]图1为本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测CPEBl扩增产物的结果；[0022]图2为本发明实施例提供的PCR扩增CPEBl基因编码序列及其负调控区域的连接产物的脂糖凝胶电泳图；[0023]图3为本发明实施例提供的含有WT或MT的CPEBl编码序列及其3’UTR序列的慢病毒感染角膜基质细胞的荧光显微镜观察结果；[0024]图4为本发明实施例提供的转染agomir-122和antagomir-122的基质细胞RT-PCR检测结果；[0025]图5为本发明实施例提供的转染agomir-122和antagomir-122的基质细胞凋亡率检测结果。具体实施方式[0026]以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。[0027]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J·，RusselI，Davidff.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor。[0028]若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品。[0029]实施例1[0030]—种包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：[0031]1从小鼠树突状细胞中扩增出CPEBl基因的编码序列[0032]根据NCBI上CPEBl的基因序列NM_030594，设计其编码序列的引物：[0033]上游引物（SEQUENCEIDNO:2:[0034]CTCCCAAGCTTATCGATAGTCCCTTAGGGCCACGC，下划线部分用于In_Fusion重组方法Takara克隆到pLVX-IRES-ZsGreenl的Cla頂每切位点中。[0035]下游引物（SEQUENCEIDNO:3:[0036]CTAAGCGATCGCTCAGTTCTTCTGGTTCCTCATTAGG，下划线部分为SgfI酶切位点，用于与其3’-UTR片段相连接。通过PCR扩增该片段，理论大小1760bp。图1为琼脂糖凝胶电泳检测CPEBl扩增产物的结果，如图1所示在1800bp左右具有明显条带，与目的片段大小（1760bp一致，表明成功扩增出了CPEBl编码序列。[0037]2通过限制性内切酶获得野生型或miR-122结合位点突变的CPEBl3’-UTR序列[0038]以本实验已构建好的包含野生型或miR-122结合位点突变的CPEBl3’-UTR序列的质粒为模版，通过SgfI、NotI双酶切，电泳和琼脂糖凝胶电泳纯化，得到5’端带SgF頂每切位点的野生型或miR-122结合位点突变序列如SEQUENCENO.4的CPEB13’-UTR序列，大小1310bp〇[0039]SEQUENCENO.4下划线部分为突变位点）：[0040]GATTCCAGCTAGAGGAGCTGGCCTTGCCCAGTGTCCTGTGGTGCCAAAGCTGTCAAGTCAGGCAGCAACTCGCTGCACAGGCGCCATGGGAGCTAGCTTTGCGCAGACAAGGGAGAATCGTAGTCACCTTTGTACTTGCTAACTCTGTCTTTGTTTCTGCACTAATTAATGCACATGAGTTTTGTCAGGTCTTGTTTTCAGTGGGGTGTGCCAGAGCAAGGACCCTCGGCTCACCCTCAAGCAATTGTAGTTTTCCCAGATTCTAGTTCCTCATTTTGCAAATGAAAATAACAACAACAACCCTGTGTCCAGAAGGTCTGACACAGATGCCTACACTTGGGTTTATTTATTAAAGCGCTTTTTACATTCCTTGCAATACTGATGGTGGTGATGCGCAGGTCTCATTGGTTCGTTCATTCTGCAGTTGCCTACAGTGCCTTTCCATTGATTTAACCCCCACCTGAACGGCATCAATTGAGTGTTCAGCTGGTGTTTTTTACTGTAACAAACAAAGGAGACTTTGCTCTTCATTTAAACCAAATCATATTTCATAGTTACGCTCGAGGGTTTTTACTGGTTCCTTTTTTGTGAGGTTAAAACAGTTTTTAAGTCGTTTGGAACAATATATTTTTTTTTCTTTCTTGGCAGCTTTTAACATTATAGCAAATTTGTGTCTGGGGGACGCTGGTCACAGTTGCAAATCAAAGCATTTGTAACCAAGAGAAAAATTATTTTATTTAAAACTGGACCGGAGGAAAAGTCTGAGCAGCTGCTGTATATAGTTTTAAATGGTTTGTGGCACCTTATGTTCACTTATGTTGGGGGAGGGTTGATAGAAGTTTTTAATCACAGTCACAGGACTTTTTCTTTTGTAACTGAGCTTAAAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCTGCTTTTTGGTGGGGGCAGGTGAAGGCCACAGGAGCCCTTTCTCTTAGAGGGGCAAATACCCTTCCTTACAACTTTTATTTGACGAATGTATGAATCAACAGTTACAGTTGACAAAGACGCTACTGGAATTGAAAACTTGACTTTTCTTTTTAATTAACGATTACTTGCCTCTCTTAGGGAAGCTGTGTGCCAAAGAGCCAGTGTCATAACCCCTCCCTCCTGCTGAGCTGATGTTGCATTGTTGCATATCCCAGCTACTCTGTGGGTTTTGTGAAGCTGTTGTGAAGTCTCTACCTCATTGTTGTATATGCAGGCAAGACTGCACTCTCCTACAGATGTGTGGAGTAAGCTGTGGTGTAATTTTTTTGGCACATAATAAACACGTTGCA[004113通过T4DNA连接酶将CPEBl编码序列与野生型WT或miR-122结合位点突变MT的CPEBl3’-UTR序列进行连接，得到的产物大小为3070bp。[0042]结果如图2所示，图2为PCR扩增CPEBl基因编码序列及其负调控区域的连接产物的脂糖凝胶电泳图。[0043]4设计CPEBl3’-UTR序列的下游引物（SEQUENCEIDN0:5，AGATCCAGTTTATCGATGCTGCAACGTGTTTATTATGTGC，下划线部分用于In-Fusion重组方法Takara克隆到pLVX-IRES-ZsGreenl的ClaI酶切位点中。通过PCR扩增步骤3得到的连接产物。[0044]5利用In-Fusion重组方法将CPEBl基因编码序列及其负调控区域克隆到pLVX-IRES-ZsGreenl的Cla頂每切位点中。[0045]将提取的载体pLVX-IRES-ZsGreenl经过ClaI酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用Nanodrop2000c测定其浓度。使用50ng经过ClaI酶切的pLVX-IRES-ZsGreenl和25ng步骤4得到的PCR产物，即野生型WT或miR-122结合位点突变MT的CPEBl编码序列及其3’UTR序列，按照In-Fusi〇n®HDCloningKitTakara说明书中的步骤进行重组连接，转化大肠杆菌DH5a。经PCR鉴定以及测序验证后，确认已将含有WT或MT的CPEBl编码序列及其3’UTR序列的片段插入pLVX-IRES-ZsGreenl的ClaI位点中。[0046]6应用：将含有WT或MT的CPEBl编码序列及其3’UTR序列的慢病毒载体，以及辅助包装质粒psPAX2、pMD2.G，在转染试剂lipofectamine3000作用下转染HEK293T细胞中包装病毒，并收集培养液上清、浓缩纯化，图3为含有WT或MT的CPEBl编码序列及其3’UTR序列的慢病毒感染角膜基质细胞的荧光显微镜观察结果。如图3所示，感染角膜基质细胞的感染效率均达90%以上。[0047]在此基础上分别转染agomir-122和antagomir-122miR-122的抑制剂hRT-PCR对慢病毒载体转染HEK293T细胞中的CPEBl转录水平的进行real-timePCR检测。并检测转染agomir-122和antagomir-122的基质细胞凋亡率。[0048]结果如图4-5所示（图4-5的结果为WT的结果;MT为对照，证明miR-122结合位点突变后，agomir-122和antagomir-122转染MT组不影响CPEBl的mRNA水平以及CPEBl的表达，基质细胞凋亡基本不受影响），处理组是指经过炎症因子了即€[、11^-10、了册丫处理;对照组添加培养基。图4中：A中所示为转染agomir-122的基质细胞中，CPEBl的表达低于对照组，B图所示为转染agomir-122的基质细胞凋亡降低，差异有统计学意义P〈0.05。图5中:A中所示为转染antagomir-122的基质细胞中，CPEBl的表达高于对照组，B图所示为转染antagomir-122的基质细胞凋亡增加，差异有统计学意义P〈0.05。[0049]图4-5可知，转染agomir-122CPEBl的表达低于对照组，角膜基质细胞凋亡降低。转染antagomir-122组中CPEBl的表达高于对照组，角膜基质细胞凋亡增加。由本发明实验结果可以推测：当microRNA-122表达下调时（角膜移植排斥组），CPEB1表达呈上升趋势，导致角膜基质细胞凋亡产生增加，从而可能促进角膜移植术后免疫排斥反应。[0050]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体，其特征在于，所述包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体为在PLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒质粒的多克隆位点插入CPEBl编码基因序列及其3’UTR序列得到的重组质粒。2.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述PLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒质粒的ClaI位点。3.—种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求1所述包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体。4.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的包含CPEBl基因负调控区域的慢病毒载体或如权利要求3所述的重组慢病毒。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为角膜基质细胞。6.—种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的包含CPEBl基因负调控区域慢病毒载体、如权利要求3所述的重组慢病毒和如权利要求4所述的宿主细胞中的一种或多种。

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