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申请/专利权人：滕州市悟通香料有限责任公司

摘要：本发明涉及一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly‑1及其编码基因与应用。一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly‑1的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次由火色杆菌属细菌Flammeovirga yaeyamensisMY04的基因组中获得兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly‑1，该酶既能降解来自褐藻胶的古罗糖醛酸片段，也能降甘露糖醛酸片段。该酶可以用于彻底降解任意MG比例褐藻胶多糖，以及高效制备较低聚合度的褐藻胶寡糖。

主权项：一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

全文数据：一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1及其编码基因与应用技术领域[0001]本发明涉及一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。背景技术[0002]褐藻胶是一种线性酸性多糖，其主链分子呈线性，由甘露糖醛酸Mannuronate，M及其C-5差像异构体古罗糖醛酸Gulur〇nate，G，通过糖苷键连续或交替链接而成。褐藻胶分子内存在均一的聚Μ段、聚G段，以及杂合的MG或GM段。褐藻胶主要产自海带、马尾藻等药、食两用的大型海洋真核藻类，是构成细胞壁和细胞间基质的主要成分。此外，条件致病菌铜绿假单胞菌和某些土壤微生物如棕色固氮菌也能分泌褐藻胶，区别在于微生物来源的褐藻胶具有乙酰化修饰。目前，日用化工、食品和医药领域应用的主体是海藻来源的褐藻胶。褐藻胶与琼胶、卡拉胶一起，是产量最大、经济价值最高、应用最为广泛的三大海洋多糖。长期以来，褐藻胶的高值化研究一直是海洋生物技术领域的重点之一。近期，耿美玉等以聚Μ段褐藻胶寡糖为原料，成功开发了具有抗淀粉样蛋白聚集活性的候选药物971，即将完成抗阿尔茨海默症AlzheimerDisease，AD的III期临床，有望成为一类新药。最新研究还表明，褐藻胶寡糖具有动态调节抗炎促炎与抗氧化促氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性等重要功能。因此，具有特定ΜG比例和聚合度大小的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。[0003]褐藻胶裂解酶，通过β-消去机制催化褐藻胶分子内糖苷键的断裂，并在寡糖产物的非还原性末端形成C4=C5不饱和双键，与C5-位的C=0羧羰基形成共辄结构，从而产生含有不饱和末端（△的寡糖产物。与化学或物理学降解方法相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制、环境污染小等优势特征，因而具有推广应用的潜质。褐藻胶裂解酶主要来源于海螺的消化系统、海藻降解菌或病毒等。受限于天然褐藻胶裂解酶的产量低，转基因褐藻胶裂解酶虽然产量高、但多数酶的水溶性和活性较差等综合因素的影响，迄今，与琼胶酶、纤维素酶等同类产品相比，少见广泛应用的商品化褐藻胶裂解酶。[0004]分析造成这种局面的原因时还发现，关于褐藻胶裂解酶的专利申请和科研文献虽然数量较多，但主要集中于产酶菌株和酶的资源发掘等初步研究，关于酶的寡糖生成特征及其底物降解特性的阐释相对较少，整体上不能提供充足的酶学特性信息，这导致工具酶匮乏，且无法精确应用。[0005]由于褐藻胶是由M、G两种糖单元组成的，因此根据酶对底物的选择性，通常可将褐藻胶裂解酶分为M-专一性、G-专一性、以及ΜG-兼性等三大类。此外，根据酶的底物降解模式，还可以分为内切酶、外切酶等两种类型。内切酶可随机、高效降解多糖，生成聚合度不同的系列不饱和寡糖;外切酶可有序降解底物，专一性生成基本糖单元，供生物体吸收利用。其中，要实现褐藻胶的彻底酶解或寡糖的高效制备，兼性内切酶是十分重要的工具之一。在已有的中国专利申请中，关于ΜG兼性或双功能褐藻胶裂解酶的申请较少，仅见如：[0006]1、中国专利文献CN105624137A申请号201410660235.3公开的一种褐藻胶裂解酶Algb的基因序列及其制备方法与应用。2、中国专利文献CN105154458A申请号201510672140.8公开的一种重组褐藻胶裂解酶及其工程菌和水解制备褐藻寡糖的方法。[0007]关于内切型褐藻胶裂解酶的申请相对更少，仅见如：[0008]1、中国专利文献CN105154458A申请号201510672140.8公开的一种重组褐藻胶裂解酶及其工程菌和水解制备褐藻寡糖的方法。2、中国专利文献CN104293754A申请号201410469861.4公开的一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。[0009]其中，又仅见中国专利文献CN104293754A申请号201410469861.4提供了详细的数据，证明了所主张的AlgL-5酶是内切型的降解模式。目前，未见关于以兼性内切型褐藻胶裂解酶的相关报道。发明内容[0010]本发明针对现有技术的不足，提供一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι及其编码基因与应用。[0011]本发明的技术方案如下：[0012]一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι，氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0013]上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1既能降解来自褐藻胶的古罗糖醛酸寡糖片段，也能降甘露糖醛酸寡糖片段，是兼性褐藻胶裂解酶。该酶降解褐藻胶后可最终产生以不饱和二糖、不饱和三糖为主产物的系列寡糖产物，其摩尔比约为1:1;且不饱和二糖中几乎全部都是AG;不饱和三糖产物含有ΔG、ΔΜ等两种非还原性末端，且二者摩尔比接近5:4。该酶的最小不饱和寡糖底物是四糖，而最小不饱和寡糖产物是二糖。该酶以内切方式降解不饱和五糖，并产生等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖。该酶在降解饱和五糖底物时，饱和二糖产物产生于底物的非还原性末端，且不饱和三糖产物生成于底物的还原性末端。[0014]上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0015]上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1的编码基因，全长共1335bp，所编码蛋白质含有444个氨基酸，分子量约为50.7kD。[0016]-种重组表达载体，在表达载体中插入了上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的编码基因。[0017]-种重组菌，在宿主细胞中转入了上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的重组表达载体。[0018]上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的编码基因、重组表达载体、重组菌在制备兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι中的应用。[0019]上述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι在降解褐藻胶、降解褐藻胶寡糖或制备不饱和寡糖中的应用。[0020]有益效果[0021]1、本发明首次由火色杆菌属细菌（FlammeovirgayaeyamensisMY04的基因组中获得兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι，该酶既能降解来自褐藻胶的古罗糖醛酸片段，也能降甘露糖醛酸片段。该酶彻底降解褐藻胶后的产物是等摩尔量的不饱和二糖与不饱和三糖，其中不饱和二糖产物基本上都是AG，而不饱和三糖产物含有△G、△Μ等两种非还原性末端，且二者摩尔比接近5:4。整体上，该酶可以用于彻底降解任意ΜG比例褐藻胶多糖，以及高效制备较低聚合度的褐藻胶寡糖。[0022]2、本发明所述的兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι以褐藻胶为底物时，在50°C、pH6·0条件下具有最高酶活力，比活力达到1261±8·2Umg，酶的温度稳定性和pH稳定性好，具有广阔的应用前景。附图说明[0023]图1、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι功能模块构成的BLASTp分析结果；[0024]图2、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（SDS-PAGE；[0025]其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD;泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10yL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量l〇yL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10yL，泳道4、经镍柱纯化的rAly-Ι，上样量10yL;[0026]图3、温度对重组褐藻胶裂解酶rAly-1活性的影响曲线；[0027]图4、pH值对重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι活性的影响曲线；[0028]图5、温度对重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι稳定性的影响曲线；[0029]图6、pH值对重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι稳定性的影响曲线；[0030]图7、金属离子及化学试剂对重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι活性的影响柱形图；[0031]图8、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解褐藻胶过程中寡糖产物的分子凝胶色谱-HPLC分析图；[0032]图中：（1UDP2,不饱和二糖；（2UDP3,不饱和三糖；（3UDP4,不饱和四糖；（4UDP5,不饱和五糖；[0033]图9、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶后所制备的不饱和寡糖片段UDP2、UDP3的HPLC分析图；[0034]图10-1、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶所制备不饱和寡糖片段UDP2的MS分析图；[0035]图10-2、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶所制备不饱和寡糖片段UDP3的MS分析图；[0036]图11-1、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶所制备不饱和寡糖片段UDP2的1H-WR图；[0037]图11-2、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶所制备不饱和寡糖片段UDP3的1H-WR图；[0038]图12、自重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5不完全降解褐藻胶的产物中分离所得UDP2-UDP6HPLC分析图；[0039]图13、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解用rAlgL-5所制备寡糖UDP2-UDP6的HPLC分析图；[0040]图14、用重组褐藻胶裂解酶rAly-1彻底降解饱和聚Μ五糖M5的HPLC分析图（紫外）；[0041]图15、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解饱和聚G五糖G5的HPLC分析图（紫外）；[0042]图16、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解还原性末端被2-AB标记的饱和聚Μ五糖Μ5的HPLC分析图（焚光）；[0043]图17、用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解还原性末端被2-AB标记的饱和聚G五糖G5的HPLC分析图（焚光）。具体实施方式[0044]以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性例如量，温度，等等），但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。[0045]生物材料来源[0046]火色杆菌FlammeovirgayaeyamensisMY04来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日，保藏编号CGMCCN0.2777。[0047]实施例1、火色杆菌FlammeovirgayaeyamensisMY04菌株基因组DNA的提取[0048]将火色杆菌（FlammeovirgayaeyamensisMY04接种至液体培养基YT04中，在28°C、200rpm的条件下，振荡培养至600nm吸光值OD600为1.2;取培养菌液10mL，在12，000Xgg，地球引力常数条件下离心15min，收集菌体沉淀；用10mL的溶菌酶缓冲液（1〇11^[1'1^8-HCl，pH8.0悬浮菌体，在12,000rmp条件下离心15min，收集菌体沉淀。[0049]上述液体培养基YT04，每升组分如下：[0050]胰蛋白胨10g、酵母提取物5.0g、氯化钠30g，用水溶解并定容至lL，pH7.2。[0051]向上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液购自上海生工生物工程有限公司）6.OmL，得到约7.OmL的菌液，分别加入浓度为20mgmL的溶菌酶溶液各280yL，使溶菌酶终浓度为800ygmL;置于冰水浴中1.0h，然后转移至37°C水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠;加入浓度为l〇〇mgmL的十六烷基磺酸钠溶液0.41mL、100mgmL的蛋白酶K溶液30yL，在52°C温浴1.Oh;加入Tris-平衡过的酚氯仿异戊醇体积比25:24:1溶液7.5mL，轻轻颠倒混匀；在10，000Xg、4°C条件下离心10min，收集上清，并加入1·OmL的NaAc-HAcpH5·2，3·0M缓冲液，以及8.5mL的无水乙醇，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的离心管中，以70%乙醇1C于-20°C，洗涤2次，微离心后弃掉上清;在10，000Xg、4°C条件下离心2min，彻底弃掉上清;将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4°C过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。[0052]实施例2、火色杆菌FlammeovirgayaeyamensisMY04菌株基因组的扫描及其序列分析。[0053]将实施例1制得的基因组DNA，采用焦磷酸测序技术进行基因组的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation,http:www.ncbi.nlm.nih.gov网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是OpenReadingFrameFinderORFFinder,http:www·ncbi·nlm·nih·govgorfgorf·html和BasicLocalAlignmentSearchToolBLAST,http:blast.nebi.nlm.nih.govBlast·cgi〇[0054]用上述生物学软件分析的结果显示，火色杆菌FlammeovirgayaeyamensisMY04菌株基因组DNA上携带一个褐藻胶裂解酶的编码基因aly-1，基因aly-1的编码区长1335bp，核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。基因aly-1所编码的重组褐藻胶裂解酶rAly-1共含有444个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0055]用BLASTp软件在线分析，结果显示，NCBI数据库中与重组褐藻胶裂解酶rAly-1的氨基酸序列相似性大于30%的都是功能未经过鉴定的蛋白质。如图1所示，BLASTp分析还推测Aly-1的蛋白质C-端含有在褐藻胶裂解酶超级家族2中保守的假定催化结构域。用生物学软件BioEdit7.0.5.3进行分析，显示蛋白质Aly-1的理论分子量约为50.7kD。用信号肽在线预测软件SignalP4·1Serverhttp:www.ebs·dtu·dkservicesSignalP在线分析，该蛋白质的N-端1-20位氨基酸为分泌型信号肽。[0056]实施例3、基因aly-1在大肠杆菌BL21DE3菌株中的重组表达[0057]以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：[0058]正向引物Aly1-F:5'-cgcGGATCCAACAATAAAGTAGAGGACGAG-3'BamHI；[0059]反向引物Alyl-R:5'-ccgCTCGAGTATAAGTTTCTTTTAATTCTATAG-3'XhoI；[ΟΟόΟ]正向引物Alyl-F中下划线标注的是限制性内切酶BamHI位点，反向引物Alyl-R下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。[0061]?〇?反应条件:95°：预变性41^11;94°：变性408,60°：退火308,72°：延伸758,35个循环;72°C延伸10min;4°C稳定10min。[0062]将PCR产物用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-30a+质粒DNA，用BamHI和XhoI双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶BamHI和XhoI均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。[0063]将经过BamHI和XhoI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a+质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行接;连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，涂布于含有50ygmL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37°C培养16h后，挑取单克隆;将单克隆接入含有50ygmL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒;将质粒用扩增引物进行PCR验证，结果得到大小为1.3kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确;接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET-30a+的BamHI和XhoI酶切位点之间插入SEQIDNO.1所示的基因aly-1，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pE30a-Alyl。[0064]将重组质粒pE30a_Alyl转化大肠杆菌菌株BL21DE3购自美国Invitrogen公司），然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行重组褐藻胶裂解酶rAly-1的诱导表达。在8,000Xg、4°C条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000乂8、4°：条件下进一步离心301^11，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对组褐藻胶裂解酶rAly-Ι进行纯化。用含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的纯化情况。结果如图2所示:经IPTG诱导表达后的BL21DE3菌体中，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的产量不低于500mgL菌体培养物;纯化后的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合;将纯化后的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι样品装入最小分子截留量为10kD的透析袋，在4°C环境中对缓冲液4进行透析。所说缓冲液4的成分是5〇11^1^8、15〇11^似：1，？!17.9，制得重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液。[0065]实施例4、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι最适温度的测定[0066]用去离子水配制质量体积浓度为0.1-1.2%的褐藻胶、聚甘露糖醛酸片段polyM和聚古洛糖醛酸片段polyG三种不同底物，加热溶解后，置于0°C、10°C、2rC、25°C、3rC、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C水浴环境中降温1h。向每900yL底物溶液中添加实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的稀释液100yL，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的稀释液浓度为lOygmL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。[0067]用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度0D54Q，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活RA定义为:各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图3所示：以如上所述三种底物测定酶活时，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι都在50°C反应时达到最大活力，这表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的最适反应温度是50°C。同时，以褐藻胶为底物时，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι在0°C展示了73%的相对酶活，这表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι具有适冷的酶学性质；在80-100°C也展示了45%以上的相对酶活，这表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι具有一定的适热酶学性质。[0068]另外，如图4所示，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι对褐藻胶、聚古洛糖醛酸片段polyG和聚甘露糖醛酸片段polyM的降解均具有较好的降解活性，初步表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι是一个兼性的褐藻胶裂解酶。[0069]实施例5、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι最适pH的测定[0070]分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH2P〇4-Na2HP〇4缓冲液、50mM的Tris-HCl缓冲液，分别与褐藻胶配制质量体积浓度gmL为0.1~1.2%的褐藻胶底物，所对应的pH值分别为5、6,6、7、8,7、8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后，置于最适温度中孵育lh，然后向每900yL底物中添加实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的稀释液100yL，混匀后开始反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度〇D54〇，并计算平均值和偏差。相对酶RA活定义为:各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示:重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的最适反应pH为6.0。在pH5~10范围内，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι相对酶活在78%以上，显示该酶具有广泛的pH反应活性。[0071]实施例6、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的温度稳定性分析[0072]将实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-1酶液在不同温度0~70°C下热处理0.5h、lh、2h后，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度gmL为0.1~1.2%的褐藻胶，按1:9体积比）的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活力。结果如图5所示:重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι在低于50°C的温度下预处理2h后，仍然具有90%的残余活性，表明该酶具有一定的热稳定性。[0073]实施例7、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的pH稳定性分析[0074]将实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的酶液，在最适温度50°C、不同的pHpH5~10环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度gmL为0.1~1.2%的褐藻胶底物溶液按1:9体积比）的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为1〇〇%相对活力。结果如图6所示，在口!15~10的范围内预处理211，以17-1酶活仍保持70%以上。这表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι对pH值耐受范围较广。[0075]实施例8、金属离子对重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι活性的影响[0076]将用去离子水配置的质量浓度为0.1~1.2%褐藻胶底物、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液、以及水按5:1:4体积比）的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为ImM或10mM，然后在50°C反应4h，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rAly-Ι的活性设定为100%。结果图7所示，在ImM或10mM浓度下：（1Na+、K+、Li+等三种一价金属试剂在10mM时对rAly-Ι的活性表现为促进作用，但Ag+具有显著抑制作用J202+、？^+、1%2+、附2+等二价金属例子对酶活具有促进作用，而其余二价、三价金属离子对酶活具有抑制作用；（3甘油、β-巯基乙醇及DTT在1OmM时对rA1y-1的活性有明显促进活性，可分别使酶活提高至125.8%、130.4%及116.4%〇[0077]实施例9、DNS_还原糖法测定重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的酶活[0078]将用去离子水配置的质量浓度为0.1-1.2%的褐藻胶、浓度为10ygmL的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液、150mmolL的HAc-NaAcpH6.0缓冲液以及水按1:1:1体积比）的比例混合后，50°C下反应4h。将反应产物在沸水浴中加热lOmin，转入冰水浴中5min，在12，000Xg、4°C条件下离心15min，收集上清;将一定体积的上清与等体积的DNS3，5-对硝基二甲苯-反应液混勾，在沸水浴中加热lOmin，降至室温，在540nm测定吸收值。用分析纯葡萄糖醛酸钠内酯作标准品，同样方法操作，绘制葡萄糖醛酸内酯的摩尔浓度与0D54Q之间的量效关系曲线。用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液中的蛋白质含量。按照国际标准定义计算酶的活力单位，即在标准条件下，每分钟内产生Ιμπιοί产物所需的酶量为1个IU。结果表明：重组rAly-Ι能以褐藻胶为底物，酶解并产生还原糖产物，酶活为1261±8.2Umg。[0079]实施例10、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解褐藻胶的产物的高效液相HPLC分析[0080]用去离子水配制质量体积浓度gmL为0.1~1.2%的褐藻胶底物，加热溶解后，置于50°C水浴环境中降温lh。向每100yL底物中添加实施例3制得的重组酶rAly-Ι的稀释液10-100yL，不足200yL体积时，用无菌去离子水补足;混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热l〇min，转入冰水浴中5min。在12,000\8、4°：条件下离心151^11，收集上清。[0081]用浓度为0.20molL的NH4HCO3溶液，平衡SuperdexPeptide10300GLGE公司）分子凝胶色谱柱，流速0.40mLmin，至少2柱床。将上述褐藻胶的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载l〇〇yg样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。[0082]如图8所示，在上述条件下，褐藻胶底物被降解后，随着酶解反应时间的增加，具有235nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且相对含量最终趋于稳定。这初步表明重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι是褐藻胶裂解酶。酶解反应的最终主产物是HPLC分析中出峰时间为40.5'和43.2'的两个寡糖产物，面积比稳定为1:1，表明二者摩尔比约为1:1。[0083]实施例11、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶的寡糖主产物的分子量鉴定[0084]按照实施例10所述，将共200mg褐藻胶用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底酶解，样品分批上样、过SuperdexPeptide10300GL分子凝胶色谱柱；GE公司），并按照出峰时间分别收集出峰时间为40.5'和43.2'的两个寡糖样品。将多次收集到的两个寡糖样品分别集中后，反复冷冻干燥以脱盐。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，进行一级质谱MS分析，确定各寡糖的相对分子量。还用重水D20溶解所得的寡糖样品，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行1H-NMR分析，最终确定各寡糖的化学结构及特征。[0085]如图9所示，用重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶后所制备的不饱和寡糖片度^^2、1]〇?3进行即^：分析，结果显示产物在23511111具有特征吸收，出峰时间分别为40.5'和43.2，，纯度均大于99%，符合进一步实验要求。[0086]在阴离子模式下进行的一级质谱分析的结果（图10表明，这两个寡糖主产物的分子量分别是352、528。这表明，上述两个寡糖主产物分别是重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι彻底降解褐藻胶之后所产生的不饱和二糖UDP2，图10-1及不饱和三糖UDP3，图10-2。[0087]综合图8、9、10的结果，不饱和二糖是重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解褐藻胶之后聚合度最小的寡糖主产物。[0088]进一步通过1H-NMR数据分析上述两种寡糖的结构特征：（1如图11-1所示，5.75ppm处的特征性化学位移值表明，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解褐藻胶后的主产物不饱和二糖UDP2几乎全部是ΔG。（2如图11-2所示5.70、5.60ppm两处的化学位移值，表明主产物不饱和三糖UDP3的非还原性末端有两种类型：ΔG和ΔM;而且两处峰的面积积分之比为100:83,表明这两类不饱和三糖的摩尔比约为5:4。[0089]实施例12、重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5不完全降解褐藻胶的产物UDP2-UDP6的制备[0090]按照专利申请（申请号201410469861.4,一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用）中实施例10所述，将共200mg褐藻胶用重组酶rAlgL-5进行不彻底酶解，产物分批上样、过分子凝胶柱SuperdexPeptide10300GL；GE公司），并按照出峰时间分别收集单个寡糖片段。将这些寡糖样品多次收集、分别集中后，反复冷冻干燥以脱盐。[0091]如图12所示，制备的寡糖片段UDP2-UDP6经HPLC检测分析，结果显示产物在235nm具有特征吸收，纯度均大于99%，符合进一步实验要求[0092]实施例13、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι最小不饱和寡糖底物的分析[0093]用去离子水和实施例12所制备的寡糖片段，包括:不饱和七糖UDP7、不饱和六糖UDP6、不饱和五糖UDP5、不饱和四糖UDP4、不饱和三糖UDP3及不饱和二糖UDP2。将这些寡糖样品分别配置底物溶液，与浓度为l〇ygmL的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液、150mmolL的HAc-NaAcpH6.0缓冲液以及水按1:1:1体积比）的比例混合后，50°C反应24h。按照实施例10所述色谱操作条件，进行HPLC分析。结果如图13所示，本申请所述重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι:[0094]1降解不饱和六糖UDP6之后产生不饱和四糖、不饱和三糖和不饱和二糖；[0095]2降解不饱和五糖UDP5之后产生等量的不饱和三糖和不饱和二糖；[0096]3降解不饱和四糖UDP4之后产生两倍的不饱和二糖；[0097]⑷与不饱和三糖或不饱和二糖反应前后无显著变化。[0098]这充分表明，不饱和四糖片段是重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的最小不饱和寡糖底物，且重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι以内切酶方式降解寡糖底物。[0099]实施例14、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶切模式的高效液相色谱HPLC分析[0100]取约含30yg饱和聚Μ五糖（M5、聚G五糖（G5的溶液，150mmolL的HAc-NaAcpH6.0缓冲液、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的稀释液，按照体积比1:1:1混勾，置于50°C水浴中反应12h。将反应体系置沸水浴中lOmin，转至冰水浴5min，在12,000Xg、4°C条件下离心至少15min。收集上清，作为重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中灭活的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液，做阴性对照反应。[0101]按照实施例10所述的色谱条件，将重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶解饱和聚Μ五糖Μ5、聚G五糖（G5的样品，以自动进样器加载20yg样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。参照分子量标准物，确定各寡糖的相对分子量。[0102]如图14,重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解饱和聚Μ五糖M5之后产生不饱和三糖UM3。如图15所示，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι降解饱和聚G五糖G5之后产生不饱和三糖UG3。这表明，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι是兼性内切型褐藻胶裂解酶，且在降解饱和型五糖底物时，其饱和型二糖产物生成自底物的非还原性末端，而不饱和三糖产物生成于底物的还原性末端。[0103]实施例15、重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶切模式的荧光-高效液相色谱HPLC分析[0104]取约含l〇yg饱和聚Μ五糖M5、聚G五糖G5的溶液，旋转蒸干。加入含过量邻氨基苯甲酰胺（2-ΑΒ、硼腈化钠的二甲亚砜DMS0溶液，混匀后置60°C水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500yL去离子水溶解样品，将样品与200yL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的饱和聚Μ五糖2AB-M5、荧光标记的饱和聚G五糖2AB-G5。同样方法标记饱和寡糖的分子量标准物。[0105]取上述2AB-M5、2AB-G5样品、150mmolL的HAc-NaAcpH6.0缓冲液、实施例3制得的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，置于40°C水浴中反应12h。将反应体系置沸水浴中1〇111；[11，转至冰水浴51]1；[11，在12,000\8、4€条件下离心至少151]1；[11。收集上清，作为重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中加热lOmin的重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι酶液，做阴性对照反应。[0106]按照实施例10所述的色谱条件，将2AB-M5、2AB-G5及其酶解产物的标记样品，以自动进样器加载50_200ng样品，其它条件不变，330nm激发，420nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。参照分子量标准物，确定各寡糖的相对分子量。[0107]如图16、17所示，用过量的重组褐藻胶裂解酶^17_1与2六8-]\[5反应后，仅少量被降解，且产生等摩尔量的2AB-M3。但是，该酶可完全降解2AB-G5，并生成等摩尔量的2AB-G3。这表明，重组褐藻胶裂解酶rAly-Ι是兼性内切型褐藻胶裂解酶，进行酶解反应时是从底物的非还原性末端释放出最小产物，包括饱和型二糖或不饱和二糖。[0108]进一步地，对比14与16，以及15与17，说明：（12-AB对饱和五糖末端标记，抑制了酶rAly-Ι对寡糖的降解活性；（2rAly-l作为兼性内切型褐藻胶裂解酶，对polyG的偏好性略大于polyM。

权利要求：1.一种兼性内切型重组褐藻胶裂解酶^17-1，氨基酸序列如3£〇10勵.2所示。2.权利要求1所述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.-种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求2所述的兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1的编码基因。4.一种重组菌，其特征在于，在宿主细胞中转入了权利要求3所述的重组表达载体。5.权利要求2所述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1的编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述重组菌在制备兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1中的应用。6.权利要求1所述兼性内切型重组褐藻胶裂解酶rAly-1在降解褐藻胶、降解褐藻胶寡糖或制备不饱和寡糖中的应用。

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