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申请/专利权人：复旦大学

摘要：本发明属于生物技术领域，具体为一种抑制甲硫氨酰tRNA合成酶产生HTL的Hcy结构类似物Hcy结构类似物及其应用。本发明使用同型半胱氨Hcy结构类似物作为甲硫氨酰tRNA合成酶合成同型半胱氨酸硫内酯HTL的抑制剂，记为AHT。通过体外生化实验，表明AHT可以抑制甲硫氨酰tRNA合成酶将同型半胱氨酸转化为同型半胱氨酸硫内酯；细胞实验显示，用该抑制剂处理细胞，显著降低了细胞内总蛋白的同型半胱氨酸化修饰水平并且降低了同型半胱氨酸的毒性效应如诱导氧化应激，激活Wntβ‑catenin信号通路等；动物实验表明，AHT可以通过降低同型半胱氨酸化修饰从而达到对神经管畸形的预防作用，并且对动物没有明显毒性，本发明抑制剂可制备治疗高同型半胱氨酸血症引起疾病的药物。

主权项：一种抑制甲硫氨酰tRNA合成酶产生HTL的Hcy结构类似物在制备预防或治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的药物中的应用，该Hcy结构类似物的结构式为：记为AHT。

全文数据：抑制甲硫氨酰tRNA合成酶产生HTL的Hcy结构类似物AHT及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Hcy结构类似物及其应用，该Hcy结构类似物作为抑制剂，用于种属）甲硫氨酰tRNA合成酶，抑制其将同型半胱氨酸转化成同型半胱氨酸硫内酯HTL，从而抑制蛋白质的N-同型半胱氨酸修饰;还涉及该抑制剂以及其可接受的衍生物在制备预防或治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的药物中的应用。背景技术[0002]高同型半胱氨酸血症Hyperhomocysteinaemia，HHcy，是指血液中的同型半胱氨酸Hcy的水平异常增高的状况。Hcy是甲硫氨酸Met代谢的中间产物，当饮食中叶酸或维生素B6,维生素B12缺乏或同型半胱氨酸代谢相关基因缺陷时，体内Hcy水平升高。高Hcy血症是心血管疾病如冠状动脉硬化性心脏病，外周血管疾病，脑血管疾病及静脉血栓形成等的危险因素，亦是出生缺陷，尤其是先天性心脏病和神经管畸型的一个十分重要的危险因素，除此之外也是老年病、糖尿病、肾脏病和一些神经精神疾病的一个重要的危险因子。[0003]由于Hcy结构与Met类似，可以被甲硫氨酰tRNA合成酶错误识别，甲硫氨酰tRNA合成酶的主要功能是在翻译过程中将Met与tRNAmet生成甲硫氨酰tRNA，Hcy是Met的代谢产物，结构与甲硫氨酸类似，因此会被甲硫氨酰tRNA合成酶错误识别，被其转化为HTL。[0004]同型半胱氨酸硫代内酯（HTL以异构肽键与蛋白质的赖氨酸残基结合，形成N-Hcy-蛋白质，这一过程称为蛋白质的N-同型半胱氨酸化。[0005]虽然HHcy是许多疾病的独立高风险因子，但是降低Hcy水平这一策略在心脑血管疾病，中风等疾病的预防治疗中并没有取得理想的效果，有报道表明，其中的原因在于，虽然叶酸及维生素B联用可以降低总Hcy水平，但是并不能降低N-Hcy抗体的水平，即不能降低蛋白质同型半胱氨酸化修饰水平。[0006]HTL的产生和蛋白质的高N-Hcy修饰被很多人认为是高同型半胱氨酸血症的主要致病机制。[0007]有报道表明，在体外试验中，甲硫氨酸可以竞争性抑制MARS对Hcy的识别，从而减少HTL的生成。但在体内由于Met是Hcy的代谢前体，会导致Hcy水平升高，因此Met不能作为体内HTL生成的抑制剂，但这提示我们其它Hcy的结构类似物可能具有抑制HTL生成的作用。[0008]诱发氧化应激及细胞凋亡是高同型半胱氨酸血症主要的致病机制之一，但其中的具体机制还不是非常清楚，但很多报道显示，HTL是高同型半胱氨酸血症导致活性氧上升的主要因素，因此，我们推测Hcy结构类似物AHT可能可以通过降低HTL的产生从而降低活性氧的生成。[0009]高同型半胱氨酸血症可以激活Wnt0-catenin信号通路，Wnt0-catenin信号通路在调节细胞增殖，细胞凋亡等活动中发挥着重要的作用，该信号通路的失衡会导致许多疾病比如神经管畸形，心脏发育畸形，神经退行性疾病，[0010]神经管畸形是与高同型半胱氨酸血症高度相关的一类出生缺陷，已有文献报道高同型半胱氨酸血症导致神经管畸形的机制在于诱发了氧化应激，从而激活了在发育中起到重要作用的Wnt-i3-catenin信号通路，我们推测AHT可以通过抑制HTL产生从而抑制活性氧产生，进而抑制Wnt-i3-catenin信号通路的异常激活，从而达到抑制神经管畸形的发生的作用。发明内容[0011]本发明的目的之一是提供一种Hcy结构类似物，作为抑制同型半胱氨酸硫内酯HTL生成的抑制剂。[0012]本发明的另一目的是提供上述Hcy结构类似物及其可接受的衍生物在制备预防或治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的药物中的应用。[0013]本发明的抑制剂也是N-同型半胱氨酸化修饰抑制剂。[0014]本发明所述的抑制剂的药物设计原理，即通过Hcy类似物抑制MARS催化的HTL生成及蛋白质N-同型半胱氨酸化修饰。[0015]本发明所述的Hcy结构类似物作为HTL及N-Hcy修饰抑制剂在HTL及N-Hcy修饰研究中的应用。[0016]本发明所述的抑制剂通过抑制HTL产生从而抑制了HTL升高造成的高N-同型半胱氨酸化修饰导致的活性氧升高及Wnt-Fcatenin信号通路激活，最终达到预防和治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的目的。本文以神经管畸形为模型，验证了本发明抑制剂的效果。[0017]本发明涉及的Hcy的结构式为：[0019]本发明提供的作为抑制同型半胱氨酸硫内酯HTL生成的抑制剂的Hcy结构类似物，其分子结构如下：[0021]本发明通过体外生化实验检测了AHT对MARS生成HTL活性的抑制作用，通过细胞试验检测了AHT对于细胞内总蛋白和抗氧化蛋白S0D12的N-同型半胱氨酸修饰水平的降低作用，并进一步检测了AHT对于活性氧累积和Wnt-Fcatenin信号通路异常激活的抑制作用，通过动物实验检测了AHT对于大鼠神经管畸形的抑制作用，并验证了这种预防作用是通过降低了蛋白质N-Hcy修饰实现的。[0022]本发明所述Hcy结构类似物AHT及其衍生物，可用于制备预防或治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的药物。[0023]HHcy相关疾病包括神经管畸形，心脏发育畸形（如先天性心脏病），心脑血管疾病如冠心病，动脉粥样硬化，中风），神经退行性疾病如阿兹海默症），糖尿病，骨质疏松等。[0024]由于N-Hcy修饰也可能发生在DNA上，本发明抑制剂抑制蛋白质的N-同型半胱氨酸化修饰但不只限于蛋白质的修饰。附图说明[0025]图1为AHT抑制MARS将Hcy转化为HTL。[0026]图2为AHT降低蛋白质N-同型半胱氨酸化修饰水平。[0027]图3为AHT降低SODN-同型半胱氨酸化修饰水平。[0028]图4为AHT抑制Hcy诱导的活性氧水平升高。[0029]图5是AHT抑制Hcy对β-catenin的累积作用，但对HTL对β-catenin的累积作用没有影响。[0030]图6为ATRA升高大鼠肝脏及血浆的Hcy水平。[0031]图7为ATRA升高大鼠胎盘，母鼠肝脏，胎鼠脑，脊髓蛋白质N-Hcy修饰水平。[0032]图8为AHT抑制神经管畸形的发生率。[0033]图9为AHT降低大鼠胎盘，母鼠肝脏，胎鼠脑，脊髓蛋白质N-Hcy修饰水平，蛋白质同型半胱氨酸化修饰水平。[0034]图10为AHT降低胎鼠脑中活性氧水平。具体实施方式[0035]下面结合实验例对本发明进一步详述但不限制本发明。[0036]实施例I:AHT的合成：[0038]称量5gDL-homocysteine于250mL圆底烧瓶中，N2置换，加入无水甲醇160mL，冰浴下逐滴加入SOCl24mL，撤去冰浴室温搅拌24h。[0039]停止反应后，旋干溶剂。该粗产物加入DCM溶解，冰浴加入10.35mLEt3N,然后加入Boc2O8.9g，室温搅拌2.5h。[0040]停止反应后，旋干溶剂。该粗产物加CH3OH80mL，H2O35mL，逐滴加入三丁基膦9.2mL，50°C搅拌30分钟。该反应体系用200mL乙醚，100mLH2O稀释，分出有机相。水相用乙醚2X100mL萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水Na2S〇4干燥，旋干，经柱层析PE:EA=20:1得无色油状物化合物2。[0042]称量3g化合物2，加入CH3OH120mL，三乙胺9.24mL，室温搅拌30min，加入碘乙酰胺2.64g，室温搅拌12h。停止反应，旋干溶剂，加入DCM溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，旋干，经柱层析①CM=CH3OH=80:1得无色油状物化合物3。[0044]称量4g化合物3,加入DCM60mL，TFA10mL，室温搅拌12h。停止反应后，旋干溶剂，油栗抽干，得黄色油状物化合物4。[0046]称量2.7g化合物4,加入NaOH11g，室温搅拌12h。停止反应后，旋掉THF，稀盐酸酸化至pH=6,旋掉水后产物加乙醇溶解，不溶物过滤，收集滤液旋干，油栗抽干得黄色固体化合物5。[0047]实施例2、薄层层析实验验证Hcy结构类似物AHT可以在体外抑制MARS将Hcy转化HTL0[0048]反应体系配置：[0049]50mMHepespH8.0，10mMMgCl2，l〇mM2-巯基乙醇，1.5mMATP，5mM同型半胱氨酸，30μΜ甲硫氨酰tRNA合成酶，AHT，在25反应IOOmin[0050]薄层层析检测HTL的生成[0051]点样：用铅笔在距硅胶板一端2cm处划直线并做点样标记。用微量移液器吸取4ul样品点于已标记的加样处，每个点的直径不得大于0.5cm，冷风吹干。[0052]展开:按正丁醇:冰乙酸：水=4:1:1配制展开剂，均匀混合后倒入展开缸，将点样的薄板置于层析缸内的展开剂显色液中，严密封口。当展开剂前沿达到薄板34位置时，将薄板取出，用吹风机吹干或置65°C烘箱中烘干。[0053]显色：显色液配好并充分混匀后倒入喷雾壶，对着烘干后的硅胶板均匀喷雾，之后置105°C烘箱中至硅胶板上出现清晰可见的氨基酸斑点。[0054]结果显示，AHT在体外实验中可以明显的抑制MARS将Hcy转化成为HTL。且抑制效果呈现剂量依赖型的下降（如图1。[0055]实施例3、AHT对细胞总蛋白同型半胱氨酸修饰的影响[0056]HTL是N-同型半胱氨酸化修饰的直接前体，AHT作为HTL产生的抑制剂，可以降低细胞总蛋白同型半胱氨酸化修饰，并且可以钝化Hcy对于细胞内总蛋白同型半胱氨酸修饰的增加作用。[0057]选用细胞:HEK293T及NIH3T3,培养条件:含10%小牛血清的DMEM，37°C，5%C〇2。[0058]药物处理:细胞培养至汇合度为80%左右时，在培养基中加入AHT，同时AHT处理组及空白对照组全部加统一浓度的Hcy以模拟高同型半胱氨酸血症，处理条件见下表：[0060]样品收集及检测:Hcy处理细胞4h后用PBS清洗细胞1-2遍，加IXSDS上样缓冲液收集并裂解细胞后，置99°C加热10-15分钟使裂解液中的蛋白充分变性，将获得的蛋白样品通过免疫印迹western-blot实验检测细胞裂解液中总蛋白的赖氨酸同型半胱氨酸化修饰水平。[0061]结果显示，AHT处理使细胞总蛋白Hcy修饰水平呈现剂量依赖型下降（图2。[0062]实施例4、AHT对于超氧化物歧化酶N-Hcy修饰的抑制作用。[0063]我们前期通过质谱实验检测到超氧化物歧化酶SODl，S㈤2均可以被同型半胱氨酸化修饰，并且经我们的实验发现，N-Hcy修饰可以使SOD的酶活力下降。AHT作为同型半胱氨酸修饰抑制剂，不仅可以降低细胞内总蛋白的N-Hcy修饰，也可以使重组SODl，S0D2的N-Hcy修饰下降，从而使SODl，S㈤2的酶活力上升。[0064]真核SOD表达及纯化：[0065]细胞转染：按实施例X中所述方法培养HEK293细胞，汇合度致90%时，使用PEI转染法将重组pcDNA3·I-Flag-SODl或pcDNA3·1-Flag-S0D2转染HEK293T细胞，12-18h换含新鲜的10%小牛血清的DMEM培养基。[0066]药物处理:转染44h后用AHT处理细胞，并在对照组及加药组细胞中全部用Hcy处理以模拟高同型半胱氨酸血症环境，加药时间及剂量同实施例X中所述。[0067]免疫沉淀:转染48h后，将细胞培养基移除，用冰冷I3BS将细胞洗涤一遍后，用0.5%NP-40裂解液裂解细胞，30min后将裂解液分别收集到干净离心管中，12000rpm离心15分钟，然后将裂解液上清转移到新的离心管中与事先用〇.5%NP_40洗涤3遍的Flag-beads混合，于4°C在转鼓上孵育3-6h。孵育后4°C，1800rpm离心，弃上清后，加入1000，10.5%NP-40裂解液，混匀后离心，弃上清，重复此步3次。[0068]洗脱：用冰冷PBS将孵育后的Beads按前述方法洗涤3次，加入用I3BS溶解的Flag-peptide，4°C转鼓上充分混勾30min后，2000rpm离心Imin，小心吸取上清至新的ep管，取部分出来加入5XSDS上样缓冲液，混匀后用免疫沉淀检测SOD同型半管氨酸化修饰水平。[0069]SOD活性检测：检测方法参照同仁化学的SOD活性检测试剂盒，样品为实施例4-[0005]中留取的洗脱上清。[0070]结果显示:AHT降低SODl，S0D2的同型半胱氨酸氨酸化修饰水平，且呈现剂量依赖型下降。对应的，AHT处理使SODI，S㈤2酶活力上升参见图3。[0071]实施例5、AHT抑制高同型半胱氨酸化修饰诱导的活性氧升高[0072]高同型半胱氨酸血症导致心血管疾病，出生缺陷，神经推行性疾病等的主要机制之一就在于Hcy可以引起细胞内活性氧的上升，而我们前期的实验提示高同型半胱氨酸血症导致活性氧上升的机制可能在于SOD的高同型半胱氨酸修饰使其酶活力降低，导致SOD清除活性氧的能力下降，从而引起活性氧的上升，由此机制我们推断，AHT作为同型半胱氨酸修饰抑制剂可以降低SOD的同型半胱氨酸修饰水平，使SOD酶活力升高，从而使活性氧水平下降。[0073]细胞培养及药物处理如实施例3中所述。[0074]活性氧检测方法参照碧云天活性氧检测试剂盒说明书货号:S0033[0075]结果显示，AHT处理使得细胞内活性氧水平呈现剂量依赖型上升，且与实施例X中[0076]WesternBlot所检测的细胞总蛋白同型半胱氨酸化修饰水平相对应（图4，修饰水平的下降伴随着活性氧水平的下降，说明在模拟高同型半胱氨酸血症的情况下，AHT可以通过降低SOD修饰从而引起活性氧水平下降。[0077]实施例6、六!11'抑制!1〇7诱导的0-〇3丨611；[11累积[0078]Hcy被报道可以诱导β-catenin累积，Wntp-catenin信号通路的失调与多种疾病的发生有关。Hcy诱导Wnt0-catenin信号通路失调且被认为是HHcy导致神经管畸形等疾病的病理机制之一。[0079]实验方法:细胞培养及药物处理如实施例3中所述。β-catenin的检测使用Westernblot方法。[0080]实验结果：Western实验结果显示，AHT处理的细胞中，Hcy处理不能再造成β-catenin的有效累积，而AHT处理对于HTL诱导β-catenin累积的作用并无太大影响，这一实验明了AHT通过抑制HTL的产生而抑制Hcy对于β-catenin累积的诱导作用。[0081]实施例7、AHT对大鼠神经管畸形发生的抑制作用[0082]实验动物:成年未经产雌性SD大鼠，由上海市西普尔-必凯实验动物有限公司提供[SYXK沪2008-0058，所有动物饲养于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SYXK沪）2008-0058]，动物实验遵守中国1988年实验动物管理条例。[0083]全反式维甲酸诱导神经管畸形模型[0084]维甲酸Retinoicacid，ATRA又称维A酸，为一种小分子量脂溶性信号分子，是维生素A在体内的自然活性代谢物，也是胚胎发育过程中不可缺少的形态发生素。但过量维甲酸摄入会导致胚胎神经管畸形的发生，全反式维甲酸（all-trans-retinoicacid，ATRA诱导是目前比较常用且稳定的建立胚胎神经管畸形模型的方法。由于已有文献报道ATRA可以使细胞内Hcy水平上升，活性氧上升。[0085]ATRA使孕鼠肝脏及血浆Hcy水平升高。[0086]实验结果显示ATRA可以升高孕鼠肝脏及血浆Hcy水平（图6，鉴于ATRA被报道可以影响Hcy代谢，我们的试验结果建议ATRA可以用作HHcy模型。[0087]ATRA升高HEK293T及NIH3T3细胞总蛋白N-同型半胱氨酸化修饰水平（图7，进一步确认了ATRA诱导的大鼠神经管畸形模型来研究Hcy结构类似物对于HHcy相关疾病预防治疗作用的模型。[0088]AHT抑制ATRA诱导的神经管畸形。[0089]1选取8〜10周龄性成熟雌性SD大鼠，体重260-280g，颗粒饲料喂养，选择连续两个动情周期正常的雌鼠，于晚16时按雌:雄=1:1的比例合笼，次日晨检查阴栓，查到阴栓的当天记为胚胎0天Embryollicday0，E0d，当天中午12时记为E0.5d，观察孕鼠生长情况，看皮毛是否光滑，精神状态是否良好，有无流产现象，选择正常孕鼠随机分笼饲养。[0090]2ATRA及AHT给药：[0091]ATRA给药:于ElOd用RA灌胃一次，剂量为50mgkg;[0092]AHT给药:在ATRA诱导的神经管畸形模型大鼠E6.5-E12.5天时每天定时用AHT的PBS溶液通过灌胃给药，给药浓度见下表：[0093]大鼠ATRA及AHT给药分组及浓度[0095]胚胎发育指标及胎鼠畸形检查。[0096]用药后每天给孕鼠称体重并记录，观察孕鼠的一般生长情况，注意有无流产现象；于E18d将孕全部脱颈处死，固定于解剖板上，剖腹取出子宫，用0.9%NaCl洗净血液，滤纸吸干水分，用万分之一电子天平称量子宫连胎重。然后仔细剖开子宫，剥离胎盘，记录胚胎活胎数，死胎数和吸收胎数，观察活胎仔大小、外观发育有无畸形，并用游标卡尺测量活胎鼠的身长、尾长，并用电子天平称活胎仔的体重和胎盘重，记录以下指标：[0097]1.母鼠净增体重：受孕第E8d称体重并记录，处死前再称一次体重，两者之差为母鼠净增体重。[0098]2.活胎数:记录正常的无畸形的活胎数。[0099]3.死胎数:记录已经死亡的胚胎数。胚胎中晚期死亡，外形完整，灰红色，对机械刺激无反应，称为死胎。[0100]4.吸收胎数:记录被吸收的胚胎数。胚胎于早期死亡，被吸收，外形不完整，只残留一个暗紫色或浅灰色的点状或块状胎块，称为吸收胎。[0101]5.脊柱裂的活胎数:观察活胎的外观，脊柱处皮肤破裂可以看到脊髓露出的即为脊柱裂。对于肉眼无法判断的胎仔，可以放到培养皿中拿到解剖镜下进行观察确认。[0102]结果显示，单独50mgkgRA给药造模大鼠的脊柱裂比率84%，同批次RA给药基础上AHT给药组大鼠脊柱裂比率为40%，AHT显著降低了脊柱裂发生的概率图8。[0103]脊柱裂比率=脊柱裂胎鼠数活胎总数[0104]AHT降低胎盘组织，母鼠肝组织，胎鼠脑，脊髓组织的总蛋白N-Hcy修饰水平。[0105]检测蛋白样品制备：[0106]ElSd解剖后立即取新鲜母鼠肝脏，胎鼠脑，脊髓以及胎盘组织：[0107]1将组织尽量剪碎，加入0.5%NP_40裂解液使用前在裂解液中补充蛋白酶抑制剂。[0108]250Hz〜60Hz超声，冰浴上进行，超5s，停5s，每个样品超声约1分钟。[0109]34°C，13000rpm，离心15分钟。吸出上清，加入5XSDS上样缓冲液。[0110]4用免疫印迹Westernblot检测组织中同型半胱氨酸化修饰水平。[0111]结果显示，AHT干预组母鼠肝组织胎鼠脑、脊髓组织以及胎盘组织的总蛋白同型半胱氨酸化水平比单独ATRA致畸组显著降低。AHT作为N-Hcy修饰的抑制剂可以用于预防神经管畸形（图9。[0112]AHT降低大鼠脑中活性氧水平[0113]活性氧上升是导致神经管畸形的主要原因之一，且有报道表明HHcy通过诱导活性氧上升而导致神经管畸形，我们进一步验证Hcy结构类似物对于HHcy产生活性氧这一效应产生的影响。取胎鼠新鲜脑组织后，用DCF及DHE荧光探针原位检测ROS的水平，发现ATRA可以使胎鼠脑组织ROS水平上升，而NAC，AHT处理组ROS水平降低（图10。

权利要求：1.一种抑制甲硫氨酰tRNA合成酶产生HTL的Hcy结构类似物在制备预防或治疗高同型半胱氨酸血症相关疾病的药物中的应用，该Hcy结构类似物的结构式为：记为AHT。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述相关疾病包括:神经管畸形，心脏发育畸形，心脑血管疾病，神经退行性疾病，糖尿病，骨质疏松。

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