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申请/专利权人：中国烟草总公司郑州烟草研究院

摘要：一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒；5）样品处理及GSHGSSG测定；6）结果分析。本发明应用SBB缓冲液重悬细胞，防止人为的氧化GSH，同时增加了样品的有效处理时间；考虑到细胞裂解液中存在活性巯基的蛋白质，为了减少非谷胱甘肽的硫化物与DTNB结合而干扰检测，在样品测定前，加入5‑磺基水杨酸用于脱去样品中蛋白质，减少了测定过程中的干扰；由于本方法同时检测GSH和GSSG，在结果处理时应用了差减法，可分别得到GSH和GSSG浓度，本发明具有耗时短，操作简便，灵敏度高，结果可靠的优点。

主权项：一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，各实验试剂的配制方法如下：1生长培养液：RPMI‑1640，10 %胎牛血清，2 mM L‑谷氨酰胺，100 IUml青霉素，100 μgml 链霉素；2磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，8 g NaCl，2.9 g Na2HPO4·12H2O，加双蒸水至1 L，pH 7.2~7.4，高压灭菌；3 1 %的胰酶：1 g胰酶定容至100 mL PBS中，冰浴下搅拌3 h~4 h，滤膜过滤，分装到10 mL离心管，于‑ 20℃ 冻存；4 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB）：其中含有：100 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10 mM硼酸盐，5 mM 丝氨酸，1 mM二乙烯三胺五乙酸，PH 7.0；5 掩蔽剂：vv 25 %的2‑乙烯基吡啶无水乙醇溶液；6脱蛋白质剂：5‑磺基水杨酸；7 GSSG标准溶液：12.5 μM的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195 μM；8反应混合液：由以下三种溶液定量混合而成： 15 mM DTNB 300 μL，5 UmL谷胱甘肽还原酶200 μL，4.0 mL PBS缓冲液；9 还原型辅酶ⅡNADPH）溶液: 10 mL PBS溶解100 mg 的NADPH，使用时稀释至 2 mgmL；10阴性对照：vv 2 %二甲基亚砜（DMSO）；2）制备卷烟烟气总粒相物；3）细胞接种培养；4）卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70 %以上，培养24 h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5 mL 20 μgmL DMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5 mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37 ℃、5 % CO2条件下培养24 h；5）样品处理及GSHGSSG测定：细胞孵育24 h后，吸去培养液，每孔加入1 mL 37℃预热的PBS洗一次, 经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5 mL离心管中重悬于500 μL SBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300 W， 3 ~5秒次，间隔10秒，重复3~5次；10000 g、4 ℃下离心10 min，收集上清液，加入vv 5 %的5‑磺基水杨酸，混均，取50 μL加入1.5 mL离心管，并加入50 μL PBS 稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50 μL, 加入相应孔内，空白孔加入50 μL PBS缓冲液；其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂1 μL 孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂；孵化1 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150 μL反应混合液，孵化2 min；样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50 μL；立即在412 nm下测定吸光值OD，每30 s记录一次OD值，记录3 min；6）结果分析：原始吸光值OD0，反应t时间时检测的吸光值ODt；反应t时间内吸光值的变化值ΔODt：ΔODt=ODt‑ OD0；所有检测孔内由相应的ΔODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔODmin；所有检测孔的ΔODmin，经空白对照ΔODmin空白校正为ΔODmin校正：ΔODmin校正=ΔODmin—ΔODmin空白ΔOD1min： GSH总检测孔的ΔODmin校正ΔOD2min： GSSG检测孔的ΔODmin校正以GSSG标准样品的ΔODmin校正和浓度，拟合标准曲线y = Ax + B样品中GSHGSSG为：。

全文数据：卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法技术领域[0001]本发明涉及到卷烟烟气总粒相物的体外毒理学研究，具体来说是一种检测卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化损伤后胞内谷胱甘肽还原态与氧化态比值GSHGSSG的测定方法。背景技术[0002]卷烟烟气是一种复杂的混合物，已报道的化学成分超过8000种，并且部分化学成分显示出一定的氧化性。当细胞或组织暴露在卷烟烟气中时，细胞体系的氧化抗氧化平衡被打破，细胞产生氧化应激，并最终导致机体产生病理性损伤。当细胞发生氧化应激时，细胞内活性氧族ROS以及活性氮族RON增加，会对脂质、蛋白质以及DNA等产生不同程度的氧化损伤，同时激活细胞内抗氧化物质如细胞外超氧化物歧化酶EC-SOD，还原型谷胱甘肽GSH，过氧化氢酶等。在这些抗氧化物中，GSH在细胞内发挥重要的抗氧化作用。GSH是细胞内含量丰富的硫醇式缩氨酸，对维持细胞氧化还原平衡发挥重要作用，被广泛作为细胞氧化应激标志物。针对细胞氧化应激状态下胞内GSHGSSG的检测，用荧光测定法较易于操作，但检测结果易受干扰;而采用高效液相色谱法分析时，样品前处理过程耗时长，并且对于大样品的检测不方便，所用的柱子也较特殊。当前，较常用的检测方法是酶循环法，该方法最初由Owen和Belcher提出（OwensCW,BelcherRV.Acolorimetricmicro-methodforthedeterminationofglutathione.BiochemJ.1965;94:705-711，之后由TietzeTietzeF.Enzymicmethodforquantitativedeterminationofnanogramamountsoftotalandoxidizedglutathione:applicationstomammalianbloodandothertissues.AnalBiochem.1969;273:502-522.和GrifTithGrifTith0W.Determinationofglutathioneandglutathionedisulfideusingglutathionereductaseand2-vinylpyridine.AnalBiochem.1980;1061:207-212.进行了改进。但该方法仍然存在一些不足之处:首先，其特异性不够高，主要是由于5，5二硫代双-2-硝基苯甲酸DTNB可与许多含活性巯基基团的物质反应，同时，检测的是谷胱甘肽总量，不能区分出GSH和GSSG;此外，该方法对样品的处理时间要求严格，从开始准备样品到检测，时间不能超过3分钟，否则将影响测定结果。发明内容[0003]本发明的目的正是针对上述存在的问题对部分操作步骤进行了改进，基于酶循环法建立一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激时胞内GSHGSSG的检测方法。[0004]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：[0005]—种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，包括以下工艺步骤：[0006]1配制实验试剂:包括⑴生长培养液，⑵磷酸缓冲盐溶液PBS，（31%的胰酶，4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液SBB，（5掩蔽剂，（6脱蛋白质剂，（7GSSG标准溶液，8反应混合液，（9还原型辅酶ΠNADPH溶液，（10阴性对照；[0007]2制备卷烟烟气总粒相物:将捕集有卷烟烟气总粒相物的剑桥滤片直接放入锥形瓶中，加入适量体积的DMS0，萃取捕集在剑桥滤片上的主流烟气粒相组分，室温振荡20min，去滤片过滤除菌，制备烟气总粒相物浓度为10mgml的样品储存液，于-80°C保存。[0008]3细胞接种培养:细胞进行消化以后，制备细胞悬液，6孔板的所有孔中每孔加入2.0mL生长培养液+450yL细胞悬液，于37°C、5%CO2条件下培养24h;[0009]4卷烟烟气总粒相物染毒:用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70%以上，培养24h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5mL20ygmLDMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37°C、5%CO2条件下培养24h；[0010]5样品处理及GSHGSSG测定:细胞孵育24h后，吸去培养液，每孔加入ImL37°C预热的PBS洗一次，经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5mL离心管中重悬于500yLSBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞功率300W，3〜5秒次，间隔10秒，重复3〜5次），10000g、4°C下离心10min，收集上清液，加入5%vv5-磺基水杨酸，混均，取50yL加入1.5mL离心管，并加入50yLPBS稀释，制得检测样品；[0011]取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50yL，加入相应孔内，空白孔加入50yLPBS缓冲液;其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂IyL孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂。孵化Imin;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150yL反应混合液，孵化2min;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50yL;立即在412nm下测定吸光值OD，每30s记录一次OD值，记录3min;[0012]6结果分析：[0013]1原始吸光值ODo，反应t时间时检测的吸光值0Dt;[0014]2反应t时间内吸光值的变化值Δ〇Dt:ΔODt=ODt-OD0;[0015]3所有检测孔内由相应的ΔODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的ΔODmin;[0016]4所有检测孔的Δ〇Dmin，经空白对照Δ〇Dmin5a校正为Δ〇Dmin校E:ΔODmin細=Δ〇Dmin—Δ〇Dmin$6[0017]Δ〇Dlmin:GSH总检测孔的Δ〇Dmin細[0018]A〇D2min:GSSG检测孔的A〇Dmin細[0019]5以GSSG标准样品的Δ〇Dmin細和浓度，拟合标准曲线y=+B[0020]6样品中GSHGSSG为：[0022]各实验试剂的配制方法如下：[0023]1生长培养液:RPMI-1640，10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100IUml青霉素，100ygml链霉素；[0024]2磷酸缓冲盐溶液PBS:0.2gKCl，0.2gKH2PO4,8gNaCl，2·9gNa2HPO4·12出0，加双蒸水至11^，口!17.2~7.4，高压灭菌；[0025]3I%的胰酶：1g胰酶定容至100mLPBS中（冰浴下搅拌3h~4h，滤膜过滤，分装到10mL离心管，于-20°C冻存；[0026]4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液SBB:其中含有：100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10mM硼酸盐，5mM丝氨酸，ImM二乙烯三胺五乙酸，PH7.0;[0027]5掩蔽剂:Vv25%的2-乙烯基吡啶无水乙醇溶液；[0028]⑶脱蛋白质剂:5_磺基水杨酸；[0029]7GSSG标准溶液：12.5μΜ的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195μΜ;[0030]⑶反应混合液现用现配）：由以下三种溶液定量混合而成：15mMDTNB5,5’_二硫代双2-硝基苯甲酸300yL，5UmL谷胱甘肽还原酶200yL，4.0mLPBS缓冲液；[0031]9还原型辅酶ΠNADPH溶液：10mLPBS溶解100mg的NADPH，使用时稀释至2mgmL；[0032]10阴性对照：2%vv二甲基亚砜DMSO。[0033]本发明建立了一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞发生氧化应激时胞内谷胱甘肽还原态GSH与氧化态GSSG比值的测定方法，其特点在于:应用SBB缓冲液重悬细胞，防止人为的氧化GSH，同时增加了样品的有效处理时间;考虑到细胞裂解液中存在活性巯基的蛋白质，为了减少非谷胱甘肽的硫化物与DTNB结合而干扰检测，在样品测定前，加入5-磺基水杨酸用于脱去样品中蛋白质，减少了测定过程中的干扰；由于本方法同时检测GSH和GSSG，所以在结果处理时应用了差减法，可以分别得到GSH和GSSG浓度，并经化简处理得到分析结果中的计算公式。本发明具有耗时短，操作简便，灵敏度高，结果可靠的优点。附图说明[0034]图I.CSC染毒A549细胞后胞内GSHGSSG变化（图中：#:JP0.01。具体实施方式[0035]本发明以下结合具体实例做进一步描述：[0036]用DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的卷烟烟气粒相组分，制备烟气总粒相物CSC浓度为10mgmL的样品储存液，可于-80°C保存。[0037]扩增培养的A549细胞经消化，制备细胞悬液（IXIO6个mL。6孔板所有孔中每孔加入2.0mL生长培养液和450yL细胞悬液，于37°C、5%C02条件下培养24h。使用生长培养液将CSC储存液调整到不同浓度，由细胞毒性试验最终确定卷烟烟气的染毒终浓度为75ygmL和100ygmL，保证细胞存活率在70%以上。细胞培养24h后，吸去培养液，6孔板每列2孔为一组分别设置为空白对照、75ygmL和100ygmLCSC处理实验组。阴性对照每孔加入2.5mL20ygmLDMSO的培养液，实验组每孔加入2.5mL不同浓度CSC的培养液，于37°C、5%CO2条件下培养24h。吸去培养液，每孔加入ImL37°C预热的I3BS洗一次，胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5mL离心管中重悬于500yLSBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，10000g、4°C下离心10min，收集上清液，加入5%vv5-磺基水杨酸，混均，取50yL加入1.5mL离心管，并加入50yLPBS稀释，制得检测样品。[0038]取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50yL，加入相应孔内，空白孔加入50yLPBS缓冲液;其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂IyL孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂。孵化Imin;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150yL反应混合液，孵化2min;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50yL;立即在412nm下检测所有孔的吸光值OD，每30s记录一次OD，记录3min。三次独立实验结果经处理后如图1所示。

权利要求：I.一种卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，其特征在于:包括以下工艺步骤：1配制实验试剂，各实验试剂的配制方法如下：1生长培养液:RPMI-1640，10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100IUml青霉素，100ygml链霉素；⑵磷酸缓冲盐溶液（PBS:0.2gKCl，0.2gKH2P〇4,8gNaCl，2.9gNa2HP〇4·I2H2O,加双蒸水至IL，pH7.2〜7.4,高压灭菌；31%的胰酶：1g胰酶定容至100mLPBS中，冰浴下搅拌3h~4h，滤膜过滤，分装到10mL离心管，于-20°C冻存；4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（SBB:其中含有：100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10mM硼酸盐，5mM丝氨酸，ImM二乙烯三胺五乙酸，PH7.0;5掩蔽剂:Vv25%的2-乙烯基吡啶无水乙醇溶液；6脱蛋白质剂:5_磺基水杨酸；7GSSG标准溶液：12.5μΜ的GSSG标准液用PBS逐级2倍稀释至0.195μΜ;8反应混合液：由以下三种溶液定量混合而成：15mMDTNB300yL，5UmL谷胱甘肽还原酶200yL，4.0mLPBS缓冲液；9还原型辅酶ΠNADPH溶液：10mLPBS溶解100mg的NADPH，使用时稀释至2mgmL；10阴性对照:vv2%二甲基亚砜DMSO;2制备卷烟烟气总粒相物；3细胞接种培养；4卷烟烟气总粒相物染毒：用生长培养液将卷烟烟气总粒相物储存液调整到不同浓度，终浓度设置至少包括2个非零浓度，使细胞存活率在70%以上，培养24h后的细胞，吸去培养液，6孔板中阴性对照组每孔加入2.5mL20ygmLDMSO生长培养液，实验组每孔加入2.5mL含有不同浓度卷烟烟气总粒相物的生长培养液，于37°C、5%CO2条件下培养24h;5样品处理及GSHGSSG测定：细胞孵育24h后，吸去培养液，每孔加入ImL37°C预热的I3BS洗一次，经胰酶消化制得细胞团样品，细胞团样品在1.5mL离心管中重悬于500yLSBB缓冲液中，细胞超声破碎仪破碎细胞，功率300W，3〜5秒次，间隔10秒，重复3〜5次；10000g、4°C下离心10min，收集上清液，加入vv5%的5-磺基水杨酸，混均，取50yL加入1.5mL离心管，并加入50yLPBS稀释，制得检测样品；取96孔板上两列孔，将样品以及标准品，一式两份，每孔50yL，加入相应孔内，空白孔加入50yLPBS缓冲液;其中，用于检测GSSG的一列样品孔内加入掩蔽剂IyL孔，另一列样品孔用于检测总的GSH，不加入掩蔽剂;孵化Imin;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入150yL反应混合液，解化2min;样品孔以及标准品孔，所有检测孔，每孔加入NADPH溶液50yL;立即在412nm下测定吸光值OD，每30s记录一次OD值，记录3min;6结果分析：原始吸光值ODo，反应t时间时检测的吸光值ODt;反应t时间内吸光值的变化值A〇Dt:AODt=ODt-OD0;所有检测孔内由相应的AODt做关于时间t的一次函数，其中斜率为该孔检测浓度下的Δ〇Dmin；所有检测孔的ΔODmin，经空白对照Δ〇Dmin〇a校正为Δ〇Dmin校Ε:ΔODmin彼[0=ΔODmin一ΔODmin閉AODlmin:GSH®检测孔的A〇Dmin_Δ〇D2min:GSSG检测孔的ΔODmin_以GSSG标准样品的ΔODmin樹0和浓度，拟合标准曲线y=Ax+B样品中GSHGSSG为：2.根据权利要求1所述的卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，其特征在于：制备卷烟烟气总粒相物具体方法如下:将捕集有卷烟烟气总粒相物的剑桥滤片直接放入锥形瓶中，加入适量体积的DMS0,萃取捕集在剑桥滤片上的主流烟气粒相组分，室温振荡20min，去滤片过滤除菌，制备烟气总粒相物浓度为10mgml的样品储存液，于-80°C保存。3.根据权利要求1所述的卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，其特征在于:细胞接种培养的具体方法如下:细胞经消化以后，制备细胞悬液，6孔板的所有孔中每孔加入2.0mL生长培养液+450yL细胞悬液，于37°C、5%C〇2条件下培养24h。4.根据权利要求1所述的卷烟烟气总粒相物诱导细胞氧化应激GSHGSSG的测定方法，其特征在于:所适用细胞为人肺癌上皮细胞系A549细胞、人支气管上皮细胞BEAS-2B和中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。

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