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申请/专利权人：河南省农业科学院植物保护研究所

摘要：本发明涉及一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法及应用，该方法以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的核苷酸序列为模板，设计扩增SPCSV-WA cp基因的特异性引物和特异性CSV探针，提取感病甘薯叶片的总RNA；用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链，然后用CSV-CP-P2引物反转录合成cDNA第二链，利用CSV-CP-P1和反向引物CSV-CP-P2进行PCR扩增反应；以SPCSV-WA cp基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲线，通过优化反应体系和反应条件，建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该方法只能检测到目的病毒，标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.239和1，扩增效率为103.568%；最低可检测到约3.31拷贝µL的阳性质粒，灵敏度比常规PCR高1000倍。本发明实时荧光定量PCR方法可用于田间甘薯样品的检测，为SPCSV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

主权项：一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV‑WA的核苷酸序列为模板，设计扩增SPCSV‑WA  cp基因的特异性引物CSV‑CP‑P1和CSV‑CP‑P2，在SPCSV‑WA cp基因内部设计特异性引物CSV‑DL1、CSV‑DL2和特异性CSV探针，设计的引物和探针序列分别为：CSV‑CP‑P1：ATGGCTGATAGCACTAAAGTCGA； CSV‑CP‑P2：TCAACAGTGAAGACCTGTTCCAG；  CSV‑DL1：5′‑GACTCAGATTTGGAAACTAA‑3′；     CSV‑DL2：5′‑TGGAGAATTGGAATATACTTG‑3′；     CSV探针：FAM‑5′‑AACTACAGTCCGAGTATGCGTCTC‑3′‑BHQ1； （2）病毒RNA的提取和RT‑PCR用柱式总RNA抽提试剂盒，提取感病甘薯叶片的总RNA；用CSV‑DL2引物反转录合成cDNA第一链，用于实时荧光定量PCR检测；然后用CSV‑CP‑P2引物反转录合成cDNA的第二链，利用正向引物CSV‑CP‑P1和反向引物CSV‑CP‑P2进行PCR扩增反应，以得到SPCSV‑WA的标准质粒DNA； （3）实时荧光定量PCR方法的建立以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV‑WA的标准质粒DNA为模板，荧光定量PCR扩增反应体系为20 µL，包括标准质粒DNA模板2 µL，预混酶Premix Ex TaqTM10 µL，ROX Reference DyeⅡ0.4 µL，正向引物CSV‑DL1和反向引物CSV‑DL2各为0.4 µL，CSV探针0.4 µL，其中正向引物、反向引物和探针的浓度均为10µmolL，用灭菌DEPC水补足20 µL；同时设立未加模板的空白对照试验；荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s并采集荧光，共40个循环。

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