买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：西北农林科技大学

摘要：本发明公开了一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，以待测肉牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增肉牛NCAPG基因部分片段；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定肉牛NCAPG基因的单核苷酸多态性位点的基因型。本发明提供的检测方法建立在NCAPG基因的SNP与生产性状关系的基础上，可用于肉牛生产性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

主权项：1.一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测肉牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增肉牛NCAPG基因部分片段；用限制性内切酶HinfI酶切PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定肉牛NCAPG基因的单核苷酸多态性位点的基因型；所述引物对P1为：上游引物：5`‑GTAGCCTGGAGCGTGAAT‑3`；下游引物：5`‑CAAGAAATGAGCACCAAAT‑3`。

全文数据：一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法技术领域[0001]本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性SNP的检测，特别涉及一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法。背景技术[0002]基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。[0003]单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphism,SNP是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander1996提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸ATCG的替换而引起的多态性。它的变异形式有:颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占23。[0004]根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类:基因编码区单核苷酸多态性Coding-regionSNPs,cSNPs、基因周边单核苷酸多态性PerigenicSNPs,pSNPs以及基因间单核苷酸多态性（IntergenicSNPs,iSNPs。[0005]研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种:一种是编码区内的同义cSNPSynonymouscSNP，S卩SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变;另一种是编码区内的非同义cSNPNon-SynonymouscSNP，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。[0006]分子育种，即分子标记辅助选择MolecularMark-AssistSelection，MAS，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。[0007]分子标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点（QTL，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段:第一阶段是家畜各性状间的遗传分析;第二阶段是蛋白质酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphism，SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。[0008]NCAPG基因是哺乳动物浓缩蛋白I复合体的调节亚基，在有丝分裂和减数分裂的过程中发挥着重要的作用。因此，研究哺乳动物NCAPG基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。[0009]目前，在中国黄牛上对于NCAPG基因的功能研究及其遗传变异与经济性状如:体长性状关联的研究仍是空白。发明内容[0010]本发明的目的在于提供一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，通过检测与经济性状关联的SNP分子标记，加快具有优质经济性状的肉牛种群的建立。[0011]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：[0012]以待测肉牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增肉牛NCAPG基因部分片段；用限制性内切酶HinfI酶切（消化PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定肉牛NCAPG基因的单核苷酸多态性位点g.42273CA的基因型；[0013]所述引物对Pl为：[0014]上游引物:5'-GTAGCCTGGAGCGTGAAT-3';[0015]下游引物:5'-CAAGAAATGAGCACCAAAT-3'。[0016]所述PCR扩增的反应程序为:95°C预变性5min;94°C变性35s，55°C退火35s，72°C延伸358,35个循环；72°：延伸1〇11^11。[0017]所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶。[0018]所述NCAPG基因的单核苷酸多态性位点（g.42273CA的基因型的判定依据为:CC基因型表现为329bp和117bp两个条带，CA基因型表现为446bp、329bp和117bp三个条带，AA基因型表现为446bp条带。[0019]本发明的有益效果体现在：[0020]本发明提供的肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性检测方法，针对NCAPG基因外显子上由C突变为A的突变位点g.42273CA，该位点是从肉牛机体免疫能力抗病能力）角度在牛基因组上筛选并进行分型检测的SNP位点，检测过程利用所述的引物对和限制性内切酶，基于简单、快速的PCR-RFLP法，实现了准确、可靠的SNP基因分型，依据NCAPG基因的SNPg.42273CA与肉牛生长性状的关系，以便用于肉牛生长性状的标记辅助选择MAS，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。附图说明[0021]图1为肉牛NCAPG基因SNP位点g.42273CA酶切产物电泳检测结果。[0022]图2为肉牛NCAPG基因SNP位点（g.42273CA不同基因型（genotype测序结果。具体实施方式[0023]下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。[0024]本发明以肉牛品种为研究对象，对NCAPG基因的编码区及非编码区设计多对引物，采用DNA池测序结合PCR-RFLP技术来进行SNPs的检测。利用统计学软件SPSS对检测到的SNPs与四个黄牛群体的多个体尺性状指标进行关联分析，寻找与黄牛生产性状具有显著相关的SNPs。[0025]一）肉牛NCAPG基因外显子区PCR-RFLP引物的设计[0026]以GenBank所公布的牛基因组序列NC_007304.6为参考，利用Primer5.0设计能够扩增包含肉牛NCAPG基因外显子区SNP位点（g.42273CA的PCR引物，其引物序列如下（弓I物设计完成时间为2017年3月）：[0027]引物对Pl为：[0028]上游引物：5'-GTAGCCTGGAGCGTGAAT-3'18nt[0029]下游引物：5'-CAAGAAATGAGCACCAAAT-3'19nt[0030]以上述引物对肉牛基因组扩增，能够扩增包含于肉牛NCAPG基因外显子区域的446bp的基因片段。该片段对应于参考序列的部分内含有限制性内切酶HinfI识别位点，当其中所含SNP位点（g.42273CA存在由C突变的A等位基因时，则HinfI的识别位点不再存在，故无法将446bp基因片段切断。据此，肉牛NCAPG基因的SNP位点（g.422730A的基因型可通过对酶切后扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行判断。[0031]二）以引物对PlPCR扩增待测肉牛的NCAPG基因片段[0032]1、肉牛样本的采集[0033]本发明具体以4个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1:[0034]表1.黄牛样本的米集[0036]2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化[0037]1冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500yL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混勾，12000rmin离心IOmin4°C，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；[0038]2在离心管中加入DNA抽提缓冲液500yL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37。:水浴Ih;[0039]3加蛋白酶K至3yL20mgmL并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1此蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；[0040]4将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500yL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀;4°C，12000rmin离心lOmin，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；[0041]5加氯仿500yL，充分混勾20min，4°C，12000rmin离心lOmin，将上清液转入另一1.5mL离心管中；[0042]6加氯仿：异戊醇混合液（24:1500yL，充分混匀20min，4°C，12000rmin离心IOmin，将上清液转入另一1.5mL离心管中；[0043]7加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30〜60min;[0044]84°C，12000rmin离心lOmin，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；[0045]94°C，12000rmin离心lOmin，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净；[0046]10干燥后的DNA溶于80〜IOOyL的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解（模板DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。[0047]若需要进一步纯化提取的基因组DNA，则：[0048]11500yL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50ygmL;[0049]125°C保温IOh左右；[0050]13等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1和氯仿分别抽提一次；[0051]1412000rmin离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；[0052]15加入I10体积3mo1L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA;[0053]16倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加入60yL灭菌超纯水溶解，4°C待检测。[0054]3、PCR扩增[0055]PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL或者2.OmL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个〇.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；[0056]PCR反应体系见表2:[0057]表2.PCR反应体系[0059]PCR反应程序：[0060]95°C预变性5min;94°C变性358,55°：退火358,72°：延伸358,35个循环;72°：延伸lOmin；[0061]对4个牛品种的个体样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得个体的包含SNP位点g.42273CA的NCAPG基因片段。[0062]三收集肉牛的表型数据[0063]收集肉牛个体4到7岁之间）的表型数据，主要包括体高、体重、体斜长、十字部高、胸围、腹围、腰角宽等生长性状，为后续相关性分析使用。[0064]四Hinfl酶切消化PCR扩增的NCAPG基因片段[0065]1、酶切反应消化体系:6yLPCR产物，IOUHinfI，灭菌纯水H2O等；[0066]2、酶切消化条件:37°C恒温培养箱中消化10h。[0067]五HinfI消化后的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析[0068]1制作12%的聚丙烯酰胺凝胶，点样后200V电压电泳2h，电泳结束后EB染色；[0069]2待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统成像；[0070]3根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性：[0071]用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性。由于肉牛为二倍体，所以NCAPG基因的SNP位点（g.422730A的酶切电泳结果为:CC基因型表现为329bp和117bp条带，CA基因型表现为446bp、329bp和117bp条带，AA基因型表现为446bp条带，参见图1。[0072]4、不同基因型个体PCR产物的测序验证[0073]对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含329bp和117bp条带的杂合子CA基因型个体其42273位的测序图的确表示为C和A，如图2所示，自左向右第13个峰为双峰。[0074]五）肉牛NCAPG基因SNP位点的频率统计分析[0075]1基因和基因型频率[0076]基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Pjj=NjjN，其中Pjj代表某一位点的JJ基因型频率;Njj表示群体中具有JJ基因型的个体数;N为检测群体的总数量。[0077]基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：[0078]式中，Pj表示等位基因J频率，Njj表示群体中具有JJ基因型的个体数量，i1一in为等位基因J的η个互不相同的复等位基因。[0079]本发明所涉及的等位基因为C和Α，所以具体的基因频率计算公式为：[0082]式中，Pc、Pa分别表示等位基因C、A等位基因的频率，Ncc、Nm和Nca分别表示CC、CA和AA基因型的个体数量，N表示总群体数目。[0083]表3.中国肉牛NCAPG基因SNP基因型频率分布表[0084][0085]六）肉牛NCAPG基因SNP位点基因效应的关联分析[0086]基因型数据:NCAPG基因SNP位点g.422730A识别的基因型CC、CA和AA[0087]生产数据：肉牛的生长性状[0088]关联分析t旲型：[0089]基因频率直接通过计算得到。按照Nei和Botstein的方法计算群体遗传学指数。也分析了群体的哈迪-温伯格平衡。使用SHEsis软件判断连锁不平衡情况。使用SPSS软件分析中国肉牛NCAPG基因型与生长性状之间的关系，所用的线性模型：[0091]其中：YijkImn为性状观察值SCS，μ为总体均值，Ai为年龄的固定效应，Ej为季节的固定效应，Ck为产犊次数的固定效应，L1为哺乳次数的固定效应，GmS基因型的固定效应，为随机误差。[0092]对牛NCAPG基因多态性位点的多态性与成年肉牛群体的生长性状指标进行关联分析，其中，生长性状指标包括:体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽和体重，结果参见表4。[0093]1牛NCAPG基因多态性与秦川黄牛生长性状的关联分析[0094]NCAPG基因SNP与成年秦川牛生长性状指标进行关联分析结果显示，SNP位点的三种基因型个体在生长性状指标中无显著性差异。[0095]2牛NCAPG基因多态性与南阳牛生长性状的关联分析[0096]NCAPG基因SNP与成年南阳牛生长性状指标进行关联分析结果显示，在腹围方面，CA基因型个体的指标显著大于CC型个体Ρ〈0.05。[0097]3牛NCAPG基因多态性与鲁西黄牛生长性状的关联分析[0098]NCAPG基因SNP与成年鲁西牛生长性状指标进行关联分析结果显示，多态性位点的三种基因型个体在生长性状指标中无显著性差异，但携带等位基因A的个体特别是AA基因型在各生长性状上总体优于CC基因型个体。[0099]⑷牛NCAPG基因多态性与郏县红牛生长性状的关联分析[0100]NCAPG基因SNP与成年郏县红牛生长性状指标进行关联分析结果显示，在体斜长方面，CA基因型个体的指标显著大于CC和AA型个体Ρ〈0.05。[0101]以上结果说明在NCAPG基因SNP位点（g.42273CA，杂合基因型个体是表型优势个体。可以将该SNP位点作为分子育种的辅助标记，并且选择CA基因型更有利于优质肉牛种质资源的建立。[0102]表4.NCAPG基因SNP位点与体尺性状的关联分析[0105]注：同一列中标注字母不同表示差异显著P〈0.05，相同字母表示不显著。[0106]总之，本发明通过对肉牛NCAPG基因上的与生长性状关联的SNP进行检测，以便用于中国肉用牛生产性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

权利要求：1.一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于:包括以下步骤：以待测肉牛全基因组DNA为模板，以引物对Pl为引物，PCR扩增肉牛NCAPG基因部分片段;用限制性内切酶Hinfl酶切PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定肉牛NCAPG基因的单核苷酸多态性位点的基因型；所述引物对Pl为：上游引物:5'-GTAGCCTGGAGCGTGAAT-3';下游引物:5'-CAAGAAATGAGCACCAAAT-3'。2.根据权利要求1所述一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为:95°C预变性5min;94°C变性35s，55°C退火35s，72°C延伸35s，35个循环;72°C延伸IOmin。3.根据权利要求1所述一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶。4.根据权利要求1所述一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述NCAPG基因的单核苷酸多态性位点的基因型的判定依据为：CC基因型表现为329bp和117bp两个条带，CA基因型表现为446bp、329bp和117bp三个条带，AA基因型表现为446bp条带。5.—种如权利要求1所述的检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:在由所述引物对Pl扩增的单核苷酸多态性位点，个体对应的生长性状优势基因型为CA。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述生长性状包括体斜长、腹围、体高、十字部高、胸围、腰角宽和体重。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述肉牛为南阳牛、郏县红牛和鲁西牛。

百度查询： 西北农林科技大学 一种检测肉牛NCAPG基因单核苷酸多态性的方法