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申请/专利权人：新疆农业大学;王世民

摘要：本发明公开一种EHV‑1血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用，EHV‑1血清抗体检测试剂盒采用由塑料小盒作为外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒外壳为长方体结构，NC膜分别包被纯化的EHV‑1 gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，以纯化的EHV‑1 gD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，按外壳盖‑NC膜‑滤纸‑外壳底的顺序组装起来，以金标SPA为二抗，以PBS为包被液，以PBS为洗涤液，采用抗原抗体特异性结合原理用来检测马血清样品中EHV‑1抗体情况，该方法快速、可视、操作简单，适合基层人员使用，具有广泛应用价值。

主权项：一种EHV‑1血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体采用如下方法步骤获得：1制备NC膜：NC膜分别包被纯化的EHV‑1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中EHV‑1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV‑1gD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中，采用以EHV‑1新疆株本地株基因组为模板设计合成特异性引物：UP：5'‑GGTGGATCCATGAAATGCAACCCGAAG‑3'Down:5'‑GGCCTCGAGTTACACAAACGTAGAGTTGCTCTT‑3'在上游引物引入BamH I、下游引物引入Xho I酶切位点，并在下游引物引入TAA终止密码子，通过PCR反应扩增去除N端信号肽及C端跨膜区的gD部分基因，将gD部分基因克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28a‑gD重组质粒，转化至BL21DE3感受态细胞内，利用含有50ugmL卡纳青霉素的固体LB培养基筛选阳性克隆株，LB液体培养基中培养阳性克隆株至OD600＝0.6时，加入0.9mmolL IPTG在25℃条件下进行诱导表达6h后收集细菌，菌体超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用PBST洗涤3‑5次既可获得gD包涵体蛋白；2组装试剂盒：按盒底‑吸水材料‑NC膜‑盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体，试剂盒采用由长方体作为试剂盒的外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，盒盖中央设有直径为0.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV‑1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，试剂盒的盒体呈长3.0cm、宽3.0cm、高0.5cm的长方体结构。

全文数据：一种EHV-1血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物检测的技术领域，具体的说，本发明涉及一种病毒血清抗体检测方法及其应用的技术领域。背景技术[0002]马鼻肺炎（iiguinerhinopneumMitis，ER是马属动物几种高度接触传染性疾病的总称，其病原体为未缘关系密切的两种疱疹病毒：马疱疹病毒1型（EHV-I和马疱疹病毒4型（EHV-4，EHV-I又称马流产病毒，主要引起母马流产。在大量饲养马匹的地区中，马匹EHV-I的感染阳性率在40%左右，部分地区一半以上的马匹血清学呈阳性结果，病马和康复带毒马是本病的主要传染源。成年马临床症状较轻而幼驹症状严重，临床表现为发热、上呼吸道粘膜的卡他性炎症以及白细胞减少。病程1周左右，幼驹可达IOd以上，妊娠毋马感染本病时易发生流产和产下弱驹，弱驹产下后多在48h内死亡，流产和弱驹死亡率可达80%以上，对养马业造成严重的经济损失。[0003]目前，补体结合方法是最常用检测EHV-I的方法。越来越多的科研人员建立了检测EHV—1的方法，如Van等（Ka_nDeMoer,Ariane,Wilks,Colin,Reginald.AntibodiesspecificforEHV-IandtheuseofsuchantibodiesinthedetectionofEHV-I[P].:W09416093,1994-07-21.利用病毒核衣壳蛋白特异性抗体建立检测EHV-I病毒的方法。晁群芳晁群芳.用Dot-ELISA检测马鼻肺炎病毒抗体的研究.新疆大学学报（自然科学版），2004，03:292-294.用HRP标记的兔源抗EHV-I血清作为检测抗体，建立了Dot-ELISA检测方法。田志革等（田志革，郭巍，赵世华，潘佳亮，冉多良，相文华，曲娟娟.马疱疹病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立.中国兽医科学，2013，09:915-918.以EHV-1gG蛋白为抗原建立间接ELSIA诊断方法。以上方法都需要在实验室进行检测，具有检测时间长、过程繁琐等特点，更适合实验室诊断，不太适合室外普通技术人员使用，不能适用于基层单位大批量样品检测EHV-I。[0004]因此，通过研究一种快捷、简单、容易携带的诊断装置，提供一种可快速检测EHV-I的方法，能够解决检测时间长、过程繁琐这一难题，能够对EHV-I感染情况做出及时准确的诊断，对于生物检测领域具有广泛的现实意义。发明内容[0005]针对目前国内外对于EHV-I血清抗体检测客观上存在检测时间长、过程繁琐，不易在日常工作中适用的技术现状，本发明旨在于提供一种EHV-I血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用的技术方案，通过创造性的设计一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，能够准确快捷有效检测出EHV-I阳性血清，该方法能够快速、可视、操作简单，不需任何仪器，适合基层人员使用，具有广泛的实用性和应用价值。[0006]本发明通过以下技术方案实现的：[0007]通过设计一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，试剂盒采用由塑料小盒作为外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒外壳为长方体结构，上盖中央设计直径为0.5cm的加样孔，NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，以纯化的EHV-IgD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，按外壳盖-NC膜-滤纸-外壳底的顺序组装起来，以金标SPA为二抗，以含有2%BSA和0.05%Tween20的PBS为封闭液，以含有0.05%TWeen20的PBS为洗涤液，采用抗原抗体特异性结合原理用来检测马血清样品中EHV-1抗体情况。[0008]本发明具体提供一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，试剂盒采用由长方体作为试剂盒的外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，盒盖中央设有直径为〇.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG。[0009]本发明中，试剂盒的盒体呈长3·0cm、宽3·0cm、高0·5cm的长方体结构。[0010]同时，本发明提供上述EHV-I血清抗体检测试剂盒的制备方法，具体采用如下方法获得：[0011]1制备NC膜:NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV-IgD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中，纯化的EHV-IgD包涵体蛋白采用将转入pET28a-gD原核表达质粒的BL21DE3大肠杆菌经0.9mmolL的IPTG、25°C诱导表达6h后，对菌体进行超声裂解并利用PBS对裂解物进行洗涤，洗涤方法为I3BS重悬的裂解产物12000rpm离心5min收集沉淀，重复3-5次即可获得gD包涵体蛋白。[0012]2组装试剂盒:按盒底-吸水材料-NC膜-盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体。[0013]进一步，本发明提供采用制备的试剂盒在EHV-I血清抗体检测中的应用，具体应用方法如下：[0014]1使用试剂盒前，将试剂盒装置水平放置，往试剂盒的NC膜先滴加含有终浓度为2%BSA和0.05%Tween20的PBS封闭液2滴，滴加量为100ul，进行封闭；[0015]⑵等待NC膜上封闭液全部深入NC膜后，加入1滴被检马血清，滴加量为50ul;[0016]3待马血清完全渗入NC膜后，加入金标蛋白A稀释液，滴加量为IOOul;[0017]4待稀释液完全渗入NC膜后，加入2滴PBST进行洗涤，滴加量为IOOul，重复3次；[0018]5结果观察：质控点及被检点全部出现橙红色斑点为阳性;质控点出现橙红色斑点，被检点未出现橙红色斑点，结果为阴性;质控点及被检测点都未出现橙红色斑点渗滤试剂盒装置失效，即可能够准确快捷有效检测出EHV-I阳性血清。[0019]本发明中，采用的封闭液由终浓度为2%BSA和0.05%Tween20的I3BS组成，采用质量分数2%的BSA和体积分数0.05%的TWeen20溶于单位体积的PBS溶液配置而成。[0020]本发明中，采用的金标蛋白A稀释液采用15nm金颗粒标记的SPA蛋白溶于PBST溶液配置而成。[0021]本发明中，采用的I3BST选用体积分数0.05%的Tween20溶于单位体积I3BS溶液配置而成。[0022]本发明中，采用的pET28a-gD原核表达质粒、BL21DE3大肠杆菌、PBS及IPTG诱导表达为本领域普通技术人员常见的材料和方法获得;采用的猪免疫球蛋白IgG可购自北京博奥森生物技术有限公司，产品编号为bs-0309P;以上所有材料本领域可通过公众渠道获得。[0023]本发明中，采用PBS溶液135mmol1的NaCl，2.7mmol1的KC1，1.5mmol1的KH2PO4和8mmol1的K2HP〇4,调pH至7·2配制而成。[0024]本发明进一步提供了包涵体形式gD蛋白制备：[0025]采用以EHV-I新疆株本地株基因组为模板设计合成特异性引物：[0026]UP:5，-GGTGGATCCATGAAATGCAACCCGAAG-3’[0027]Down:5，_GGCCTCGAGTTACACAAACGTAGAGTTGCTCTT-3’[0028]在上游引物引入BamHI、下游引物引入Xho頂每切位点，并在下游引物引入TAA终止密码子，通过PCR反应扩增去除N端信号肽及C端跨膜区的gD部分基因，将gD部分基因克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28a-gD重组质粒，转化至BL21DE3感受态细胞内，利用含有50ugmL卡纳青霉素的固体LB培养基筛选阳性克隆株，LB液体培养基中培养阳性克隆株至OD6QQ=O.6时，加入0.9mmolLIPTG在25°C条件下进行诱导表达6h后收集细菌，菌体超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用PBST洗涤3-5次既可获得较纯的gD重组蛋白。[0029]通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：[0030]1本发明提供一种EHV-I血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用，通过创造性的设计一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，能够准确快捷有效检测出HlV-I阳性血清，该方法能够快速、可视、操作简单，不需任何仪器，适合基层人员使用，具有广泛的实用性和应用价值。[0031]2本发明采用包被抗原得以改进:将可溶的gD蛋白通过人工去除其两端跨膜区进行原核表达，得到了包涵体形式gD蛋白。经Westernblot试验验证该蛋白依然与马EHV-I标准阳性血清有较好反应原性，该蛋白具有纯化简单，蛋白自身稳定，更适合作为诊断试剂应用。附图说明[0032]图1显示为EHV-I血清抗体检测试剂盒结构示意图，其中，1-盒盖，2-NC膜，3-吸水材料，4-盒底。[0033]图2显示为EHV-I血清抗体检测试剂盒立体图。[0034]图3显示为gD基因PCR扩增结果图，其中，M-DL2000MarkerTakara，1-阴性对照，2-gD基因扩增产物。[0035]图4显示为pET28a-gD重组质粒BamHIXhoI双酶切电泳结果图，其中，M-DL2000MarkerTakara，l_pET28a空载体，2_pET28a_gD重组质粒。[0036]图5显示为gD包涵体蛋白原核表达及纯化结果图，其中，M-低分子量蛋白MarkerTakara，1-诱导后的BL21①E3大肠杆菌，2-诱导后的pET28a-gD转化菌，3-洗涤回收的gD包涵体蛋白。[0037]图6显示为gD包涵体蛋白抗原性检测结果图，其中，M-光谱彩虹预染Marker北京康为世纪生物科技有限公司），Ι-gD包涵体蛋白。[0038]图7显示为免疫渗滤装置效果图。具体实施方式[0039]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。[0040]本发明中设备和材料有:MYCYCLER型PCR扩增仪购自美国BioRad公司）、.DYY-12型电脑三恒多用电泳仪电源购自北京六一生物科技有限公司）、LG2000型数码凝胶成像仪购自美国热电公司），LATaq酶、DNA产物胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶均购自Takara公司，pET28a原核表达载体为本实验室保存、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Omega公司、DH5a、BL21DE3购自天根生化科技北京）有限公司、LATaq酶、BamHI、XhoI内切酶购自Takara公司，金标SPA、猪IgG均购自北京博奥森生物技术有限公司，特异性引物由上海生工生物工程技术有限公司采用常见的方法获得合成。[0041]本发明中试剂有：2%BSA和0.05%Tween20，135mmol1的NaCl，2.7mmol1的KC1，1.5mmol1的KH2PO4和8mmol1的K2HPO4。[0042]本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。[0043]实施例一:EHV-I血清抗体检测试剂盒[0044]本发明具体提供一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，EHV-I血清抗体检测试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，试剂盒采用由塑料小盒作为外壳，预制的NC膜和吸水材料构成试剂盒内芯，盒体呈长3.0cm、宽3.0cm、高0.5cm的长方体结构，盒盖中央设有直径为0.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG。[0045]在使用本发明提供的EHV-I血清抗体检测试剂盒时，先将NC膜包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，再将吸水材料放置在试剂盒底部，最后将盒盖封闭盒体。[0046]本发明提供的EHV-I血清抗体检测试剂盒，制作过程简单，可通过加样孔观察到试剂盒内部，对于生物检测领域具有广泛的现实意义。[0047]实施例二:EHV-I血清抗体检测试剂盒的制备[0048]本发明具体提供一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，具体制作步骤如下：[0049]1制备NC膜:NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV-IgD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中纯化的EHV-IgD包涵体蛋白采用将转入pET28a-gD原核表达质粒的BL21DE3大肠杆菌经0.9mmolL的IPTG，25°C诱导表达6h后，对菌体进行超声裂解并利用PBS对裂解物进行洗涤，洗涤方法为PBS重悬的裂解产物12000rpm离心5min收集沉淀，重复3-5次即可获得较纯的gD包涵体蛋白。[0050]2组装试剂盒:按盒底-吸水材料-NC膜-盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体。[0051]实施例三:EHV-I血清抗体检测试剂盒的应用[0052]采用上述实施例一和实施例二提供的试剂盒在EHV-I血清抗体检测中的应用，具体应用方法如下：[0053]1使用试剂盒前，将试剂盒装置水平放置，往试剂盒的NC膜先滴加含有2%BSA和0.05%Tween20的PBS封闭液2滴，滴加量为100ul，进行封闭；[0054]⑵等待NC膜上封闭液全部深入NC膜后，加入1滴被检马血清，滴加量为50ul;[0055]3待马血清完全渗入NC膜后，加入金标蛋白A稀释液，滴加量为IOOul;[0056]4待稀释液完全渗入NC膜后，加入2滴PBST进行洗涤，滴加量为IOOul，重复3次；[0057]5结果观察：质控点及被检点全部出现橙红色斑点为阳性;质控点出现橙红色斑点，被检点未出现橙红色斑点，结果为阴性;质控点及被检测点都未出现橙红色斑点渗滤试剂盒装置失效，即可能够准确快捷有效检测出EHV-I阳性血清。[0058]本发明中，采用的封闭液由终浓度为2%BSA和0.05%Tween20的I3BS组成，采用质量分数2%的BSA和体积分数0.05%的TWeen20溶于单位体积的PBS溶液配置而成。[0059]本发明中，采用的金标蛋白A稀释液采用采用15nm金颗粒标记的SPA蛋白溶于PBST溶液配置而成。[0060]本发明中，采用的I3BST选用体积分数0.05%的Tween20溶于单位体积PBS溶液配置而成。[0061]本发明中，采用PBS溶液135mmol1的NaCl，2.7mmol1的KC1，1.5mmol1的KH2PO4和8mmol1的K2HP〇4,调pH至7·2配制而成。[0062]实施例四：包涵体形式gD蛋白的制备[0063]本发明提供一种包涵体形式gD蛋白，具体制备步骤如下：[0064]以EHV-I新疆株本地株基因组为模板扩增去除N端信号肽及C端跨膜区序列，克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28-gD重组质粒，转化至BL21DE3感受态细胞内，0.9mmolLIPTG，25°C诱导6小时，收集细菌，超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用I3BST洗涤3-5次既可获得较纯的gD重组蛋白。[0065]其中，纯化的EHV-IgD包涵体蛋白采用将转入pET28a-gD原核表达质粒的BL21①E3大肠杆菌经0.9mmolL的IPTG诱导表达6h后，对菌体进行超声裂解并利用PBS对裂解物进行洗涤，洗涤方法为PBS重悬的裂解产物12000rpm离心5min收集沉淀，重复3-5次即可获得较纯的gD包涵体蛋白。[0066]实施例五:对照试验[0067]按照实施例三步骤进行操作对50份马血清样品进行检测，检测结果与商品化马鼻肺炎ELISA诊断试剂盒购自西班牙INGENASA公司）进行比较，常见的商品化马鼻肺炎诊断试剂盒为西班牙INGENASA公司公开提供。[0068]商品化马鼻肺炎ELISA诊断试剂盒操作具体方法如下：[0069]1加入100ul被检马血清至ELISA反应孔，37°C温箱孵育Ih。[0070]2每孔加入200ulPBS溶液洗涤ELISA反应板，震荡洗涤5min。[0071]3重复⑵步骤3-5次。[0072]4每孔加入酶标二抗稀释液100ul，37°C温箱孵育30min。[0073]5重复步骤2和3。[0074]6加入100ul底物显色液，避光显色10min左右，终止液终止显色反应。[0075]7酶标仪OD45Q波长进行测量样品吸光度。[0076]8判定结果。[0077]结果表明两种方法检测结果符合率达86%4350，免疫渗滤方法在15min可得到结果，ELISA方法需至少2h才能得到结果，免疫渗滤方法在整个操作过程中，无需特殊仪器设备，结果直观，操作简单，见表1。由此可见，本发明提供的一种EHV-I血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用的技术方案，该方法能够快速、可视、操作简单，不需任何仪器，适合基层人员使用，具有广泛的实用性和应用价值。[0078]表1.两株不同检测方法比较[0079][0080]通过上述系列实施例提供了一种EHV-I血清抗体检测试剂盒，能够准确快捷有效检测出EHV-I阳性血清，该方法能够快速、可视、操作简单，不需任何仪器，适合基层人员使用，具有广泛的实用性和应用价值。

权利要求：1.一种EHV-I血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体采用如下方法步骤获得：1制备NC膜:NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV-IgD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中，采用以EHV-I新疆株本地株基因组为模板设计合成特异性引物：UP:5’-GGTGGATCCATGAAATGCAACCCGAAG-3’Down:5’-GGCCTCGAGTTACACAAACGTAGAGTTGCTCTT-3’在上游引物引入BamHI、下游引物引入Xho頂每切位点，并在下游引物引入TAA终止密码子，通过PCR反应扩增去除N端信号肽及C端跨膜区的gD部分基因，将gD部分基因克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28a-gD重组质粒，转化至BL21DE3感受态细胞内，利用含有50ugmL卡纳青霉素的固体LB培养基筛选阳性克隆株，LB液体培养基中培养阳性克隆株至0D600=0.6时，加入0.9mmolLIPTG在25°C条件下进行诱导表达6h后收集细菌，菌体超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用PBST洗涤3-5次既可获得gD包涵体蛋白；2组装试剂盒:按盒底-吸水材料-NC膜-盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体，试剂盒采用由长方体作为试剂盒的外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，盒盖中央设有直径为0.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV-IgD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，试剂盒的盒体呈长3.Ocm、宽3.Ocm、高0.5cm的长方体结构。2.如权利要求1所述的一种EHV-I血清抗体检测试剂盒在EHV-I血清抗体检测中的应用，其特征在于，具体应用方法如下：1使用试剂盒前，将试剂盒装置水平放置，往试剂盒的NC膜先滴加含有终浓度为2%BSA和0.05%Tween20的PBS封闭液2滴，滴加量为IOOul，进行封闭；⑵等待NC膜上封闭液全部渗入NC膜后，加入1滴被检马血清，滴加量为50ul;⑶待马血清完全渗入NC膜后，加入金标蛋白A稀释液，滴加量为IOOul;⑷待稀释液完全渗入NC膜后，加入2滴PBST进行洗涤，滴加量为IOOul，重复3次；5结果观察：质控点及被检点全部出现橙红色斑点为阳性;质控点出现橙红色斑点，被检点未出现橙红色斑点，结果为阴性;质控点及被检测点都未出现橙红色斑点渗滤试剂盒装置失效，即可准确快捷有效检测出EHV-I阳性血清。

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