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申请/专利权人：中国科学院成都生物研究所

摘要：本发明提供了一种快速鉴定大麦春化基因VERNALIZATION1HvVRN1等位基因的引物、试剂盒及检测方法，该引物包括1条正向引物和3条反向引物形成的3对引物对，通过两次普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳实现的。第一次PCR反应中用一对引物对全部待测材料进行检测，第二次PCR反应中用两对引物对第一次PCR反应中不能很好区分及没有扩增的材料进行检测，综合两次PCR结果，可以明确地鉴定全部12种HvVRN1等位基因。经用以前报道的参考品种和测序验证，本发明鉴定HvVRN1等位基因结果可靠、重复性好，为大麦种质资源和杂交育种后代HvVRN1等位基因的有效鉴定和选择，提供了一种经济、快速的实用检测方法。

主权项：一种快速鉴定HvVRN1等位基因的引物，其特征在于，包括1条正向引物和3条反向引物形成的3对引物对，其中，正向引物序列为  HvVRN1‑F：TCATCATCTTCTCCACCA反向引物序列为  HvVRN1‑R1：TACGGATAAAGGTGGATA                HvVRN1‑R2：ACAGTTGCTTACCGTTTG                HvVRN1‑R3：CCACAATGTTATGTCTTCG。

全文数据：一种快速鉴定大麦HvVRN1等位基因的引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于植物分子标记技术领域，涉及对大麦春化作用关键基因HvVRNl的实用检测，特别是基于PCR技术，对大麦种质资源和育种后代HvVRNl等位基因的高效快速鉴定。背景技术[0002]开花是植物生命过程的重要阶段，植物在合适的环境下才能正常开花，从而获得具有生活力的种子，保证物种的延续。小麦、大麦等越冬植物开花需要长时间环境低温的诱导，该过程即春化作用vernalization。春化低温能促进幼穗的分化和发育，根据品种对春化作用需求的程度不同，通常将品种划分为冬性、春性和半冬性三种类型。冬性品种在开花前需要经历较长的低温过程大约4-10°C约6周）才能保证植株正常开花，否则开花时间会延迟，不能正常结实。在幼苗能安全越冬的地区采用秋季播种冬性品种，冬季气温能满足品种的春化需求，而在冬季气温严寒、幼苗不能越冬的地区，在春季播种春化需求较弱的春性品种也能正常开花结实，顺利完成生命周期的全过程。半冬性品种对春化需求的程度介于冬性和春性材料之间，因此可以根据其春化作用的程度选择在适宜的区域种植。[0003]春化特性是影响大麦和小麦品种适应性的重要性状之一。春化基因VERNALIZATI0N1VRNl是调节春化作用的关键因子，其基础表达水平与开花时间密切相关。VRNl基因的第一内含子包含了该基因表达的重要调控元件，是该基因表达的抑制子，VRNl受春化低温的诱导表达水平逐渐增强。未经春化低温作用的野生型大麦VRNl基因HvVRNl基础表达水平最低，因此含有野生型HvVRNl的品种为冬性品种，需要经历较长时间的低温春化作用才能正常开花结实。然而，由第一内含子上大片段插入和缺失形成的11种大麦HvVRNl春化基因等位变异HvVRNl-I~11，具有不同程度的基础表达水平及相应的最佳开花适应值，分别适应于不同的地区生长，从而形成了大麦广泛分布的遗传基础。[0004]能够准确快速地鉴定大麦HvVRNl等位基因是大麦适应性育种及种质资源研究必备的基础和前提。随着HvVRNl等位基因陆续地被发现，人们对HvVRNl等位基因检测的分子标记也不断地更新，比如Cockram在CropScience上发表的文章（PCR-BasedMarkersDiagnosticforSpringandWinterSeasonalGrowthHabitinBarley·中，对8个HvVRNl等位基因设计了分子标记，但该标记只能将8个HvVRNl等位基因分为两组:6个春性等位基因一组，2个冬性等位基因为一组，而组内等位基因却不能区分;Hemming2009年在MolGenetGenomics上发表的文章（RegionsassociatedwithrepressionofthebarleyHordeumvulgareVERNALI.ZATIONlgenearenotrequiredforcoldinduction.中，对11种HvVRNl等位基因（包括野生型和10种HvVRNl-I~10变异型）分别设计了分子标记，但是每一种等位基因的检测都需要一对不同的引物和一次PCR，步骤繁琐，费时费力，特别是对于大规模大麦种质的鉴定，工作量大到难以想象，很难在科学研究或育种实践中应用。发明内容[0005]鉴于前人发明的分子标记对于鉴定HvVRNl等位基因的种种缺陷，本发明提供了一种快速简单地鉴定12种HvVRNl等位基因（包含野生型和11种HvVRNl-I~11变异型）的引物、试剂盒和检测方法，该引物基于2次普通PCR和琼脂糖凝胶电泳技术，可以准确高效地将12个大麦HvVRNl等位基因清晰地区分开，是大规模大麦种质资源鉴定和品种选育过程中HvVRNl基因分子标记辅助选择marker-assistedseIection，MAS的理想引物和检测方法。[0006]本发明提供的大麦HvVRNl等位基因鉴定技术，是根据已经报道的HvVRNl第一内含子上大片段插入缺失的大小和位置，设计基因特异引物，通过两次普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳实现的。[0007]本发明中分子标记包括1条正向引物和3条反向引物形成的3对引物对，其中，[0008]正向引物序列为HvVRNl-F:TCATCATCTTCTCCACCA，如SEQIDN0.1所示；[0009]反向引物序列为HvVRNl-Rl:TACGGATAAAGGTGGATA，如SEQIDN0·2所示；[0010]HvVRNl-R2:ACAGTTGCTTACCGTTTGjnSEQIDN0.3K*;[0011]HvVRNl-R3:CCACAATGTTATGTCTTCGjnSEQIDN0.4K*。[0012]本发明还保护包含上述引物的试剂盒，优选的，所述试剂盒还包括Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶。[0013]本发明保护该引物或试剂盒在鉴定HvVRNl等位基因的应用。[0014]本发明提供了一种使用所述分子标记快速鉴定HvVRNl等位基因的检测方法，包括以下步骤：[0015]1使用所述引物对HvVRNl-FHvVRNl-R3对大麦DNA进行PCR扩增鉴，并将扩增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，4.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-I，0.8kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-3，7.3kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-9，3.9kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-10,6.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-11;[0016]2使用所述两个引物对HvVRNl-FAHvVRNl-Rl+HvVRNl-R2对步骤⑴第一次PCR反应中不能区分及没有扩增的大麦DNA进行PCR扩增检测，并将扩增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，2.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-6,3.7kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-7，3.Okb条带鉴定为野生型等位基因HvVRNl;1.8kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-4，2.Okb条带鉴定为等位基因HvVRNl-5，3.Okb条带鉴定为等位基因HvVRNl-8，无扩增产物的鉴定为等位基因HvVRNl-2。[0017]本发明中设计的1条正向引物和3条反向引物形成3对引物对，第一次PCR反应中用一对引物对全部待测材料进行检测，可以明确地鉴定办¥1^1-14.5-此）、办¥1^1-30.8-kb、HvVRNl-97·3-kb、HvVRNl-103·9-kb和HvVRNl-116·5-kb等位基因；但是HvVRNl-45.6-1^和办¥8附-55.8-1^，办¥8附-23.3-1^和办¥8附-83.2-1^扩增片段相近，所以在第一个PCR反应中不能很好区分;而HvVRNl-6、HvVRNl-7及野生型等位基因HvVRNl在第一个PCR反应中没有扩增产物。第二次PCR反应中用两对引物对第一次PCR反应中不能很好区分及没有扩增的材料进行检测，可以明确地鉴定HvVRNl-62.5-kb、HvVRNl-73.7-kb及野生型等位基因HvVRNl3.0-kb，并且可以区别HvVRNl-41.8-kb和HvVRNl-52.0-kb，HvVRNl-2无扩增产物和HvVRNl-83.0-kb。所以综合两次PCR结果，可以明确地鉴定全部12种HvVRNl第一内含子等位基因。经用以前报道的参考品种和或测序验证，本发明鉴定HvVRNl第一内含子等位基因结果可靠、重复性好，为大麦品种资源HvVRNl等位基因的有效鉴定和选择，提供了一种经济、快速的实用检测方法。附图说明[0018]图1为12个HvVRNl等位基因在第一次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；[0019]图2为8个HvVRNl等位基因在第二次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；[0020]图3为本发明引物对部分中国大麦地方品种HvVRNl等位基因组成的第一次PCR鉴定；[0021]图4为本发明引物对部分中国大麦地方品种HvVRNl等位基因组成的第二次PCR鉴定；[0022]其中，图3、图4中各泳道检测的品种及等位基因为：I，ZDMO1159HvVRN1-2;2，ZDM00155HvVRNl-4；3,ZDM00162HvVRNl-8；4,ZDM08956HvVRNl-9；5,ZDM03584HvVRNl-10；6,ZDM03867HvVRNl-8；7,ZDM03944HvVRNl-68,ZDM09113HvVRNl-I；9,ZDM03597HvVRNl;10，ZDM03812HvVRNl-2;11，ZDM03979HvVRNl;12，ZDM04001HvVRNl-11；13,ZDM03447HvVRNl-6；14,ZDM03936HvVRNl-4；15,ZDM03908HvVRNl-8;M:标准分子量。具体实施方式[0023]下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0024]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。[0025]实施例1:DNA的提取及PCR引物设计[0026]1实验材料[0027]实验材料见表1，包含已经报道的12种不同HvVRNl等位基因的参考品种，ID为各等位基因序列在NCBI数据库中的GeneBank编号。[0028]表1实验材料[0029][0030]2DNA的提取及检测[0031]采用CTAB方法提取大麦种子总DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。[0032]3PCR引物设计[0033]引物序列见表2。第一次PCR反应采用引物对HvVRNl-FHvVRNl-R3，第二次PCR采用正向引物HvVRNl-F与反向引物HvVRNl-Rl和HvVRNl-R2形成的两对引物对对目的基因进行PCR扩增，不同等位基因的预期扩增目的片段大小见表3。[0034]表2PCR引物序列[0035][0036]表3HvVRNl等位基因扩增片段大小[0037][0038]-表示没有扩增产物[0039]实施例2:PCR体系的建立及测序验证[0040]利用实施例1的引物对分别含有12种不同HvVRNl等位基因的材料进行PCR扩增及检测：[0041]PCR反应体系总体积为25ul，包括IXPCRBufferMg2+Free、1.5mMMgCI2、200uMdNTP、1.5U的Taq酶和150ng的模板DNA，上下游引物分别为2pmol。[0042]第一次PCR扩增条件为：95°C预变性5min，94°C变性30S，57°C退火30S，72°C延伸4min，34个循环，最后72°C延伸lOmin。[0043]第二次PCR扩增条件为：95°C预变性5min，94°C变性30S，57°C退火30S，72°C延伸2min，34个循环，最后72°C延伸lOmin。[0044]PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳0.5-lh，EB染色后用凝胶成像系统观察并照相。每个等位基因材料均能扩出唯一一条清晰的带，结果见图1、2和表3。由图1可知，第一次PCR反应可以明确地鉴定HvVRNl-I4.5-kb、HvVRNl-30.8-kb、HvVRNl-97.3-kb、HvVRNl-103·9-kb和HvVRNl-II6·5-kb等位基因；但是HvVRNl-45·6-kb和HvVRNl-55·8-kb，HvVRNl-23·3-kb和HvVRNl-83·2-kb扩增片段相近，所以在第一个PCR反应中不能很好区分;而HvVRNl-6、HvVRNl-7及野生型等位基因HvVRNl在第一个PCR反应中没有扩增产物。第二次PCR反应中用两对引物对第一次PCR反应中不能很好区分及没有扩增的材料进行检测，结果如图2所示，第二次PCR反应可以明确地鉴定HvVRNl-62.5-kb、HvVRNl-73.7-kb及野生型等位基因HvVRNl3.0-kb，并且可以区别HvVRNl-41.8-kb和HvVRNl-52·0-kb，HvVRNl-2无扩增产物）和HvVRNl-83·Ο-kb。表3列出了所有HvVRNl等位基因在2次PCR反应中的扩增片段大小。[0045]进一步用引物对HvVRNl-FHvVRNl-R3对含有HvVRNl-I、HvVRNl-2、HvVRNl-3、HvVRNI-8、HvVRNI-10、HvVRNI-11及野生型等位基因的参考品种进行扩增，用引物对HvVRNl-FHvVRNl-Rl对含有HvVRNl-6和HvVRNl-7等位基因的参考品种进行扩增，用引物对HvVRNl-FHvVRNl-R2对含有HvVRNl-4、HvVRNl-5和HvVRNl-9等位基因的参考品种进行扩增，利用相应的引物对扩增片段直接测序，测序结果经与NCBI中对应的HvVRNl等位基因序列进行比对分析，证明每个等位基因的特异性扩增片段与预期结果吻合。所以，综合两次PCR的结果，能够明确地鉴定全部12种HvVRNl等位基因，可以作为特异性分子标记用于HvVRNl等位基因的辅助选择。[0046]实施例3:我国大麦地方品种HvVRNl等位基因的鉴定[0047]利用本发明的分子标记鉴定来自中国8个大麦生态区中的98份地方品种的HvVRNl春化基因组成见图3、4、表4，DNA提取及分子标记PCR检测方法同实施例1。结果共鉴定出10种HvVRNl等位基因，HvVRNl-8和野生型等位基因为优势等位基因，频率分别高达38.78%和32.65%，其中HvVRNl-8主要分布在我国中炜度的春大麦区，而野生型等位基因主要分布在长江中下游冬大麦区。其它8个等位基因的频率范围为1.02~7.14%。对比文献记载，品种的春化基因型与其对春化作用的要求基本吻合，也与种植区域内的气候条件相适应。[0048]表4:98份中国大麦地方品种的HvVRNl等位基因鉴定[0049][0050][0051]*国家大麦种质资源库统一编号[0052]上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种快速鉴定HvVRNl等位基因的引物对，其特征在于，包括1条正向引物和3条反向引物形成的3对引物对，其中，正向引物序列为HvVRNl-F:TCATCATCTTCTCCACCA反向引物序列为HvVRNl-Rl:TACGGATAAAGGTGGATAHvVRNl-R2：ACAGTTGCTTACCGTTTGHvVRNl-R3：CCACAATGTTATGTCTTCG；所述HvVRNl等位基因为大麦春化基因VERNALIZATI0N1等位基因。2.如权利要求1所述的引物对在鉴定HvVRNl等位基因中的应用。3.包含如权利要求1所述引物对的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶。5.如权利要求3或4所述的试剂盒在鉴定HvVRNl等位基因中的应用。6.-种使用权利要求1所述引物对快速鉴定HvVRNl等位基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴使用所述引物对HvVRNl-FHvVRNl-R3对大麦DNA进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，4.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-l，0.8kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-3,7.3kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-9,3.9kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-10,6.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-11;⑵使用所述两个引物对HvVRNl-FHvVRNl-Rl和HvVRNl-FHvVRNl-R2对步骤（1第一次PCR反应中不能区分及没有扩增的大麦DNA进行PCR扩增，并将扩增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，2.5kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-6，3.7kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-7，3.Okb条带鉴定为野生型等位基因HvVRNl;1.8kb条带鉴定为等位基因HvVRNl-4，2.Okb条带鉴定为等位基因HvVRNl-5，3.Okb条带鉴定为等位基因HvVRNl-8，无扩增产物的鉴定为等位基因HvVRNl-2。

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