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申请/专利权人：湖南杂交水稻研究中心

摘要：本发明公开了一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，包括以下步骤：1提取水稻DNA作为PCR模板；2设计SSR引物进行PCR扩增；3设计和修饰单链DNA探针；4芯片表面修饰；5连接探针与芯片；6PCR产物与探针分子杂交：将步骤2得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；7根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单，快速，成本低等优点；解决了水稻中垩白基因Chalk5的有效、快速检测的问题。

主权项：1.一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1提取水稻DNA作为PCR模板；2设计SSR引物进行PCR扩增；3设计和修饰单链DNA探针；4芯片表面修饰；5连接探针与芯片；6PCR产物与探针分子杂交：将步骤2得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；7根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。

全文数据：一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法技术领域本发明属于基于分子生物学和SPR光学原理的基因检测鉴定技术领域，尤其涉及一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法。背景技术水稻是全世界重要的粮食作物之一。我国是水稻最大的生产与消费国，随着我国经济高速发展以及人们的生活水平不断提高，人们对于水稻品质要求也在不断提升。因此，选育优良品质的水稻新品种，是水稻育种的重要目标之一。20世纪70年代开始我国大面积推广杂交水稻，并开展了一系列对于水稻米质的研究和改良，经过多年努力，我国在提高杂交水稻品质方面取得了巨大进步。但是一些米质的性质，比如垩白度，垩白粒率等优质达标率不高。垩白是衡量水稻外观品质的一个重要指标，建立快速、准确检测垩白相关基因的方法，是选择低垩白水稻品种的基础。垩白是指稻米胚乳中组织疏松而形成的白色不透明的部分，它极大地影响了稻米可食用性产量，同时对稻米透明度等外观品质、蒸煮食味和营养品质等都有大的影响。垩白基因控制座位比较复杂，其中Chalk5是一个能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因。2014年，Chalk5已经被成功克隆。Chalk5编码一种液泡上的有无机焦磷酸水解作用和H+转运作用的焦磷酸转移酶。进一步的研究表明：在水稻品种中的Chalk5启动子的两个核苷酸多态性在很大程度上说明了Chalk5基因mRNA含量的不同，促进了水稻垩白的自然变异。在珍汕97和H94中，Chalk5决定了腹白、心白的形成。在另外一些品种中，垩白还受Chalk8-1、Chalk8-2、Chalk8-3和Chalk10等基因控制。另外，还有决定垩白的一些微效基因起作用。目前认为以PCR为基础的检测方法进行Chalk5基因的检测是最好的方法。通过设计Chalk5相关引物进行普通PCR，就可以进行检测。还可以对PCR产物直接进行测序，但这种过程检测到的只是占主导地位的基因型。基因芯片也能进行Chalk5基因的检测，但成本高，常用放射性元素进行标记，对人体危害性大。随着生物传感器与基于生物传感技术的发展，表面等离子谐振技术SPR是近年来快速发展的一种新型生物化学检测方法。它是一种无需标记、无需分离纯化、可用于实时定量检测某些固定于传感芯片上的组分，可确定反应物种类和浓度，且可用于相对小量物质进行检测的重要手段。SPR光学原理是基本表面等离子体谐振物理光学现象。发生谐振时的入射角依赖于金属界面的折射率，而金属界面上的生物分子的结合会改变此处的折射率，从而引起谐振角的改变，通过监测谐振角的变化，可以实现实时检测芯片表面的生物分子的结合与分离的状态。基于SPR传感器工作原理，通过生物薄膜技术，分子杂交技术等在生物表面基质层上包裹SA蛋白，SPR生物传感器对溶液中的特定的生物分子进行检测。由于控制水稻垩白基因位点很复杂，故开发这种全新的SPR检测分析新方法很具挑战性。研发新方法的最终目的是建立一种高灵敏度、高准确性、快速检测水稻性状的检测方法，将SPR传感技术在水稻品质检测方面得到广泛应用，使选择育种更加快速有效。发明内容为了克服现有技术中的缺点，本发明的目的是提供一种新的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振SPR测定方法。该方法具有快速通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单，成本低等优点。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，包括以下步骤：1提取水稻DNA作为PCR模板；2设计SSR引物进行PCR扩增；3设计和修饰单链DNA探针；4芯片表面修饰；5连接探针与芯片；6PCR产物与探针分子杂交：将步骤2得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；7根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。上述方法中步骤1优选采用CTAB法提取OD260280值在1.7-2.0之间的DNA样品。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤2SSR引物根据Chalk5基因启动子区缺失的第991-979位点序列CACAAGACACTG见SEQNO.21设计；因为该区域的缺失是引起水稻垩白增多的原因。例如：本发明设计了一套引物序列：Chalk-F-CATCCAAATAGAGGAGCCAC；见SEQNO.22；Chalk-R-TGAAAAAGCCATAAAAAAGC，见SEQNO.23。上述方法中PCR扩增及产物检测的具体过程：将30μl的2×EcoTaqPCRSuperMix、3μl的SSR引物、6μl的模板DNA和21μl的超纯净水混合，在95℃预变性3min，然后98℃变性10s，58℃下退火30s，72℃下延伸50s，循环34次；在72℃下保持4min，最后在16℃下保温1min。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤3根据水稻品种9311和明恢63的Chalk5基因序列在启动子第991-979区间缺失差异设计单链DNA探针。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤3设计的单链DNA探针长度为20-60bp，3’端修饰生物素。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤3设计的单链DNA探针序列如SEQNO.1-15所示。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤4的芯片表面修饰过程如下：1将羧基修饰的芯片安装到表面等离子体仪上，用缓冲液冲洗芯片表面至基线；2用NHSN-羟基琥珀酰亚胺和EDC1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合水溶液流过羧基修饰的SPR芯片，进行表面活化；3用链霉亲和素蛋白SA的缓冲液流过芯片表面，将链霉亲和素蛋白固定在芯片表面；4用牛血清蛋白溶液流过芯片表面来封闭残存的活性位点。进一步优选：1将羧基修饰的芯片安装到表面等离子体仪上，用缓冲液双蒸水以1500μlmin流速冲洗芯片表面至基线。2用200μl的NHS和EDC的混合水溶液以10μlmin流速流过羧基修饰的SPR芯片，其中200mM的EDC和50mM的NHS等体积混合，进行表面活化。3用200μl的链霉亲和素蛋白的醋酸缓冲液以10μlmin流速流过芯片表面，将链霉亲和素蛋白固定在芯片表面。链霉亲和素蛋白的醋酸缓冲液中链霉亲和素蛋白浓度50μgml；醋酸缓冲液，0.01M，pH＝4.5。4用200μl的牛血清蛋白溶液以10μlmin流速流过芯片表面来封闭残存的活性位点。牛血清蛋白溶液的浓度为1.0molL，溶剂为以HCl调pH为8.4的乙醇胺。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤5连接探针与芯片过程是将探针溶液流过芯片表面，使探针表面的生物素与传感芯片表面的亲和素进行反应。优选将探针溶解于PBS缓冲溶液配制浓度为1μM的溶液。优选探针溶液以10μlmin流速流过芯片表面。探针溶液用量为100μl。步骤6进行之前，将步骤2PCR扩增产物用15×SSPE缓冲溶液和超纯水配制PCR待测产物。优选用15×SSPE缓冲溶液和超纯水配制的PCR待测产物，PCR产物浓度为16％。进一步优选：取16μlPCR产物，34μl15×SSPE缓冲溶液，50μl超纯水三者混匀，得到PCR产物浓度为16％的上样样品。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤6PCR产物与探针分子杂交的过程：取PCR待测产物，加热变性上样，反应在SPR仪上进行。进一步优选：上样样品95℃加热变性3min。进一步优选：将100μl样品上样，反应在SPR仪上进行反应，流速为10μlmin，反应仓温度40℃，反应10min。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，步骤7以水稻品种9311与明恢63的SPR信号值为基准值，如果SPR信号值50V，就以明恢63SPR信号值99V为基准，将其信号值减去99V；如果SPR信号值50V，就以9311信号值50V为基准，将其信号值减去50V；SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度成正相关。所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，所述的水稻品种籼型常规稻、籼型恢复系、籼型两系不育系或籼型三系不育系。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本方法提供了一种新的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振SPR测定方法，解决了水稻中垩白基因Chalk5的有效、快速检测的问题。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单，快速，成本低等优点。附图说明图1为本发明SSR引物扩增的各品种条带。图2为本发明设计的第一类探针SPR信号曲线；其中：F1、粤晶丝；F2、P88S；F3、明恢63；F4、9311。图3为本发明设计的第二类探针SPR信号曲线；其中：F1、9311；F2、PA64；F3、空育131；F4、IR841。图4为SPR信号反应曲线确定探针适合浓度；其中：F1、10μM，F2、1μM，F3、0.1μM，F4、0.01μM。图5为用于确定PCR产物适合浓度的SPR信号曲线图。其中：F1、25％，9311；F2、16％，9311；F3、25％，空育131；F4、16％，空育131。图6为以明恢63SPR信号值99V为基准的样本的SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度值绘制图。图7为以9311信号值50V为基准的样本的SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度值绘制图。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中出现的各品种水稻公众均可从湖南杂交水稻研究中心购买获得。具体操作方法如下：1水稻基因组DNA的提取：采用常规的CTAB法提取水稻基因组DNA，将提取的DNA溶解于50ulddH2O中，将水稻基因组DNA置于Nanodrop2000分光光度计检测，取OD260280值在1.7-2.0之间的DNA样品保留，作为PCR的模板，保存于-20℃冰箱备用。其中CTAB法详见：MurrayMG，ThompsonWF.RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA.[J].NucleicAcidsResearch,1980,819:4321.2PCR扩增及扩增产物检测：PCR反应体系60μl：其中2×EcoTaqPCRSupermix30μl，SSR引物3μl，DNA模板6μl，ddH2O21μl。反应程序：95℃预变性3min,98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸50s，34个循环；72℃4min,16℃保温1min。扩增产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出产物片段。图1中，各电泳条带代表的品种如下表1-1,1-2,1-3所示。表1-1表1-23芯片探针的设计：水稻垩白基因Chalk5有多个基因位点跟水稻垩白相关联，根据水稻品种9311和明恢63基因序列在启动子991-979区间缺失差异，设计单链DNA探针。探针的长度为20-60bp，优选5`端进行polyT修饰，3`端进行生物素修饰擎科生物公司合成。对探针序列设计的进一步探索：①水稻垩白基因Chalk5有多个基因位点跟水稻垩白相关联，根据参考文献中9311和明恢63基因序列差异设计了两类探针。第一类探针根据9311和明恢63基因序列在启动子991-979区间12bp碱基缺失设计探针；第二类探针根据9311和明恢63基因序列在编码区483、927两个位点单碱基突变设计探针见表2。②设计检测水稻的探针。设计单链DNA探针，在单链DNA探针的5端不加任何端基与分别加上PloyA、PloyC、PloyG、PloyT，探讨对其信号的影响，3`端进行生物素修饰擎科生物公司合成。表2探针序列Table2probesequence备注：探针1-15为第一类探针；探针16-20为第二类探针，见SEQNO.1-20。探针分类的依据：根据基因突变类型进行分类。基因突变类型：第1类碱基的缺失或者插入而这类碱基数目相差较大；第2类碱基的替换这类一般情况为单碱基的突变。483、927两个位点为单碱基突变类型，而这两个位点的突变对水稻垩白度有一定的影响。结果：芯片上连接同一探针1进行检测样本。根据图2SPR信号反应曲线，有明显的信号差，确定第一类探针可以使用。芯片上连接同一探针18进行检测样本。根据图3SPR信号反应曲线，信号差很弱，确定第二类探针无法使用，相差一个碱基所检测的信号太弱了。4SA蛋白的固定SPR芯片IB-CM，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经羧基修饰芯片由华安麦科生物公司提供.羧基修饰的SPR芯片IB-CM安装到SPR仪器上，用缓冲液ddH2O以1500μlmin流速冲洗芯片表面至基线；然后，200μlNHS和EDC的混合水溶液以10μlmin流速流过羧基SPR芯片200mMEDC和50mMNHS等体积混合，进行表面活化。再把200μlSA蛋白的醋酸缓冲液SA,50μgml；醋酸缓冲液，0.01M，pH＝4.5以10μlmin流速流过芯片表面，将SA蛋白固定在SPR芯片IB-CM表面，最后用200μlBSA1.0molL的以HCl调pH为8.4的乙醇胺溶液溶液以10μlmin流速流过芯片表面来封闭残存的活性位点。5探针与芯片的连接：包被SA蛋白的SPR芯片安装到SPR仪器上，根据上述实验探针与芯片结合的适合浓度，取100μl探针溶液以10μlmin流速流过芯片表面，使探针表面的生物素与传感芯片表面的亲和素进行反应，再用缓冲液冲洗至基线。其中用同一探针分别包被在传感芯片的供不同样品检测的不同流池。将探针溶解于PBS缓冲溶液配制100μl浓度分别为0.01μM，0.1μM，1μM，,10μM，的溶液流经过芯片，反应10分钟。根据图4SPR信号反应曲线确定探针适合浓度，结果显示探针浓度为1μM时，探针与芯片的结果最好，最终选择探针的浓度为1μM。6PCR产物检测浓度的选择用15×SSPE缓冲溶液，超纯水配制的100μlPCR待测产物，浓度分别为25％，16％，流速为10μlmin，反应10分钟。其中PCR产物选择水稻品种9311与空育131。浓度为16％的PCR产物配制方法为：取16μlPCR产物，34μl15×SSPE缓冲溶液，50μl超纯水混匀。浓度为25％的PCR产物配制方法为：取25μlPCR产物，25μl15×SSPE缓冲溶液，50μl超纯水混匀。根据图5信号反应曲线确定PCR产物适合浓度。9311与空育131浓度分别为25％，16％都有结合信号，但是在16％浓度时信号更加明显。说明PCR产物在16％浓度时分子杂交最好。7PCR产物与探针分子杂交：根据上述实验PCR产物与探针进行分子杂交浓度16％,取16μlPCR产物，34μl15×SSPE缓冲溶液，50μl超纯水三者混匀，95℃加热变性3min，将100μl样品上样，反应在SPR仪上进行反应，流速为10μlmin，反应仓温度40℃，反应10min。8米质分析根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。在PCR产物合适浓度16％下，检测了16份不同品系的水稻PCR产物各品系的品种标号、品种名称和籼粳类型如下表3，检测的SPR信号值、各品种公布的垩白度见表4。表3品种标号品种名称籼粳类型品种标号品种名称籼粳类型1华航31号籼型常规稻9华标1号籼型常规稻2象牙香占籼型常规稻10密阳46籼型恢复系3金花占籼型常规稻11恩恢58籼型恢复系4粤香占籼型常规稻12明恢63籼型恢复系5Lemont籼型常规稻139311籼型恢复系6川大粒籼型常规稻14广占63-4S籼型两系不育系7秀水63籼型常规稻15株1S籼型两系不育系8巨穗稻籼型常规稻16粤泰A籼型三系不育系以上各品种的水稻公众可从湖南杂交水稻研究中心获得。表4水稻SPR信号与实际垩白度对比表根据米质好垩白度低的明恢63与米质差垩白度高的9311的基因序列在启动子991-979区间缺失差异设计探针，以9311与明恢63SPR信号值为基准值，再以SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度值绘制图。由于是以明恢63与9311为设计引物的参考序列，故以这两个材料的信号值为基准，减去这个基准值就是为了减去其中背景的干扰。确定垩白度含量的依据可以为：如果SPR信号值50V，就以明恢63SPR信号值99V为基准，将其信号值减去99V；如果SPR信号值50V，就以9311信号值50V为基准，将其信号值减去50V。总的来说，SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度基本成正相关。SPR信号反映出的结果与各品种的实际垩白度具有较好的一致性，结果见图6和7，证明本方法在对水稻垩白度测试中具有良好的适用性。以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。序列表110湖南杂交水稻研究中心120一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法16023170SIPOSequenceListing1.0210121139212DNA213未知Unknown4001cctattatatctaaccttgacacttgtactgcacaagac39210221137212DNA213未知Unknown4002aaccttgacacttgtactgcacaagacactggtgcgc37210321139212DNA213未知Unknown4003actgcacaagacactggtgcgctcctttgaacagctttt39210421156212DNA213未知Unknown4004tttttttttttttttttcctattatatctaaccttgacacttgtactgcacaagac56210521154212DNA213未知Unknown4005tttttttttttttttttaaccttgacacttgtactgcacaagacactggtgcgc54210621155212DNA213未知Unknown4006ttttttttttttttttactgcacaagacactggtgcgctcctttgaacagctttt55210721153212DNA213未知Unknown4007aaaaaaaaaaaaaacctattatatctaaccttgacacttgtactgcacaagac53210821151212DNA213未知Unknown4008aaaaaaaaaaaaaaaaccttgacacttgtactgcacaagacactggtgcgc51210921152212DNA213未知Unknown4009aaaaaaaaaaaaaactgcacaagacactggtgcgctcctttgaacagctttt522101021153212DNA213未知Unknown40010cccccccccccccccctattatatctaaccttgacacttgtactgcacaagac532101121151212DNA213未知Unknown40011ccccccccccccccaaccttgacacttgtactgcacaagacactggtgcgc512101221152212DNA213未知Unknown40012cccccccccccccactgcacaagacactggtgcgctcctttgaacagctttt522101321153212DNA213未知Unknown40013ggggggggggggggcctattatatctaaccttgacacttgtactgcacaagac532101421151212DNA213未知Unknown40014ggggggggggggggaaccttgacacttgtactgcacaagacactggtgcgc512101521152212DNA213未知Unknown40015gggggggggggggactgcacaagacactggtgcgctcctttgaacagctttt522101621145212DNA213未知Unknown40016ccaaaattagcgccgtaaaattagtgatatttttcaatgactcac452101721143212DNA213未知Unknown40017aaaattagtgccgtaaaattagtgatatttttcaatgactcac432101821145212DNA213未知Unknown40018gacttctccaaaattagcgccgtaaaattagtgatatttttcaat452101921146212DNA213未知Unknown40019ttttcactagaagctgtaacaactttggtttcttttggccatcttt462102021149212DNA213未知Unknown40020ttttcactagaagctgtaactactttggtttcttttggccatctttcct492102121112212DNA213水稻Oryzasativa40021cacaagacactg122102221120212DNA213未知Unknown40022catccaaatagaggagccac202102321120212DNA213未知Unknown40023tgaaaaagccataaaaaagc20

权利要求：1.一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1提取水稻DNA作为PCR模板；2设计SSR引物进行PCR扩增；3设计和修饰单链DNA探针；4芯片表面修饰；5连接探针与芯片；6PCR产物与探针分子杂交：将步骤2得到的PCR产物与探针进行分子杂交，反应在SPR仪上进行反应；7根据检测结果，对水稻的米质垩白度进行相关性分析。2.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤2SSR引物根据Chalk基因启动子区缺失的第991-979位点序列CACAAGACACTG设计。3.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤3根据水稻品种9311和明恢63的Chalk5基因序列在启动子第991-979区间缺失差异，设计单链DNA探针。4.根据权利要求3所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤3设计的单链DNA探针长度为20-60bp，3’端修饰生物素。5.根据权利要求3所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤3设计的单链DNA探针序列如SEQNO.1-15所示。6.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤4的芯片表面修饰过程如下：1将羧基修饰的芯片安装到表面等离子体仪上，用缓冲液冲洗芯片表面至基线；2用NHS和EDC的混合水溶液流过羧基修饰的SPR芯片，进行表面活化；3用链霉亲和素蛋白的缓冲液流过芯片表面，将链霉亲和素蛋白固定在芯片表面；4用牛血清蛋白溶液流过芯片表面来封闭残存的活性位点。7.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤5连接探针与芯片过程是将探针溶液流过芯片表面，使探针表面的生物素与传感芯片表面的亲和素进行反应；步骤6进行之前，将步骤2PCR扩增产物用15×SSPE缓冲溶液和超纯水配制PCR待测产物。8.根据权利要求7所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤6PCR产物与探针分子杂交的过程：取PCR待测产物，加热变性上样，反应在SPR仪上进行。9.根据权利要求1所述的水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：步骤7以水稻品种9311与明恢63的SPR信号值为基准值，如果SPR信号值50V，就以明恢63SPR信号值99V为基准，将其信号值减去99V；如果SPR信号值50V，就以9311信号值50V为基准，将其信号值减去50V；SPR信号值和基准值差值的绝对值与垩白度成正相关。10.根据权利要求1所述的一种水稻垩白基因Chalk5的表面等离子体共振测定方法，其特征在于：所述的水稻品种为籼型常规稻、籼型恢复系、籼型两系不育系或籼型三系不育系。

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