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申请/专利权人：塞尔夫斯库林有限公司

摘要：本发明涉及用于检测HPV诱导的高级别癌变前病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中ZIC1和或GHSR基因中的超甲基化，由此这样的超甲基化指示存在具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。本发明进一步包括ZIC1和或GHSR基因在用于检测ZIC1和或GHSR甲基化的这样的方法和试剂盒中的用途。

主权项：1.一种用于检测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中GHSR和或ZIC1基因的超甲基化，由此这样的超甲基化指示存在具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。

全文数据：用于HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症及其高级别前期病变的ZIC1和GHSR分子诊断标志物技术领域[0001]本发明涉及癌症预防和医学诊断领域；并涉及用于癌症，尤其是人乳头瘤病毒HPV诱导的浸润性癌及其高级别前期病变，比如浸润性宫颈癌和癌变前宫颈病变、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的分子诊断标志物。尤其，本发明涉及ZICl和GHSR基因组调控序列作为hrHPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症及其具有浸润潜力的癌前病变的标志物的用途。背景技术[0002]宫颈癌是世界范围内女性第四大常见癌症，并且每年造成大约250，000例癌症死亡。[0003]宫颈鳞状细胞癌的发展特征在于一系列癌变前病变，即所谓的宫颈上皮内瘤样病变CIN，其分级为1至3级，分别指轻度非典型增生CINl、中度非典型增生CIN2和重度非典型增生原位癌CIN3XINl也被称为低级别鳞状上皮内病变LSIL并且CIN2和CIN3一起被称为高级别鳞状上皮内病变HSIL。对于宫颈腺癌，原位腺癌ACIS是确定的前期病变。原则上，这些癌变前病变是可逆的，但是病变越严重，自发性消退的机会就越低。宫颈癌被认为是可预防的疾病，因为癌前阶段可以通过脱落细胞学检测，并且在必要时治疗相对容易，仅有轻微副作用。宫颈筛查的目的是早期诊断高级别癌前病变（即，CIN23和原位腺癌和可治疗的癌性病变，从而降低浸润性宫颈癌的死亡率。一般的医疗实践包括治疗所有形态学证实的CIN2、CIN3和原位腺癌的女性，以便防止宫颈癌的发展。[0004]在过去的十年中，已经确定了宫颈癌发生是由感染高风险人乳头瘤病毒hrHPV引发的。已经显示分别干扰P53和Rb肿瘤抑制剂途径的病毒癌基因E6和E7的表达对肿瘤发生和恶性表型的维持两者都是必需的。因此，对hrHPV进行测试看起来是有吸引力的初步筛查工具。然而，与癌发生的多阶段过程相一致，hrHPV感染的细胞向浸润性癌细胞发展要求宿主细胞基因组中额外的改变。只有一小部分感染高风险HPV的女性将发展为高级别癌前宫颈病变CIN23，并且如果不治疗，则发展为宫颈癌。在大多数患有宫颈癌变前病变的女性中，该病变自发性消退。在参与基于人群的筛查的女性中，约5%-6%测试为阳性hrHPV.然而，她们中最多只有20%1%的参与女性患有彡CIN23。因此，通过hrHPV测试的初级筛查将伴随大量冗余的后续程序和女性不必要的焦虑，除非可将标志物适用于允许将hrHPV阳性的女性分级为多CIN23和多原位腺癌风险的宫颈涂片。[0005]主要的挑战是将HPV测试为阳性的女性的百分比降低到那些具有临床意义病变的患者。一种模式是使用细胞学作为用于hrHPV阳性女性的二级所谓分类测试。尽管如此，这仍使得大量细胞学正常的hrHPV阳性女性筛查人群中3.5%的女性）中仍有10%的患有或获得多CIN3.此外，细胞学对于可以在家中采取的自采样的宫颈阴道样本行不通，因为这些样本不代表宫颈的细胞学状态。另一种模式是使用HPV1618基因分型.然而，这使得非HPV1618型的女性尽管程度较轻但也存在多CIN23和多原位腺癌的风险。因此，需要补充或可替换的分类工具，以将hrHPV阳性女性分级为患有或未患有彡CIN23和彡原位腺癌的hrHPV阳性女性。[0006]倘若特异性和灵敏性足够高，使用基于癌症基因中宿主细胞变化的疾病标志物对宫颈癌进行初级筛查提供了有前途的可替换方案。在乏质量控制的细胞学检查，并且实施HPV阳性女性的后续算法是复杂的低收入和中等收入国家对于这个选择特别感兴趣。在这些国家，自采样已显示有助于获得宫颈筛查（Laczano-Ponce等，Lancet·2011;378:1868-1873。在这个意义上，具有在自样本self-sample中也有效的标志物是极其有用的。似乎由像医生或护士这样的医学技术人员获得的阴道涂片上的标志物与女性自己收集的阴道拭子上的标志物在“表现”方面存在巨大差异。很多适用于医生提供的样本的标志物在自样本中似乎没有用。在低收入和中等收入国家，在自样本中代替医生样本中有效的必要性很高，因为在这些国家中，人均医疗人员较少，并且让其他人采取阴道样本通常存在文化上的问题。[0007]子宫内膜癌是许多发达国家中最常见的妇科恶性肿瘤（Siegel等，CACancerJ.Clin.，642014第9-29页）.早期子宫内膜癌有非常好的预后.因此，早期检测将增加治愈的机会，并且避免或减少繁琐且昂贵的治疗干预。由于已经证实了宫颈刮擦物中的肿瘤细胞脱落，因此通过非侵入性取样对子宫内膜癌进行早期检测是可行的。然而，宫颈刮擦物的常规细胞学检查对于子宫内膜癌的检测的灵敏性非常低.测试与子宫内膜癌相关联的分子改变（比如DMA甲基化）可以为子宫内膜癌的早期检测提供有希望的途径（deStrooper等，了（：1111?七11〇1.2014;6712:1067-71，81^〇1111-611162等67116。〇1011。〇1.2015;1371:14-22。类似地，最近已提出了测试宫颈刮擦物中癌症特异性DNA改变，用于检测卵巢癌Kindle等，SciTranslMed.2013;5167:1-21〇发明内容[0008]发明人现已发现一种用于检测HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症及其高级别癌变前病变的方法，其中所述方法包括检测细胞中ZICi和Sghsr基因的超甲基化，借此这样的超甲基化指示存在具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。优选地，在这样的方法中，所述HPV诱导的高级别癌变前病变或HPV诱导的浸润性癌是高级别癌前的宫颈病变或浸润性宫颈癌，更优选是高风险HPV诱导的浸润性癌。优选地，所述非HPV诱导的妇科癌症是子宫内膜癌。优选地，所述非HPV诱导的肛门生殖器癌症是外阴癌或阴茎癌。[0009]在本发明的优选实施方式中，在如图1和图2所示的富含CpG序列中检测超甲基化。[0010]本发明还涉及如上所限定的方法，其中所述超甲基化是与可比较的正常细胞相比，测试细胞中ZICl和或GHSR富含CpG的启动子和或基因序列增加的甲基化。[0011]在本发明的优选实施方式中，通过使用选自由BssHII、MspI、NotI和Hpall组成的组中的甲基化敏感性限制性核酸内切酶进行超）甲基化的检测。在本发明的另一个优选实施方式中，使用纳米技术进行超）甲基化的检测。在本发明的可替换优选实施方式中，经由甲基化特异性PCR进行超）甲基化的检测，该甲基化特异性PCR基于DNA的亚硫酸氢盐修饰，然后进行靶向富含CpG序列的特异性PCR反应。优选地，在这样的方法中，试剂是与如图1或图2所示的核酸结合的核酸探针或引物，并且更优选地，所述核酸探针或引物具有可检测的记D[0012]在本发明的另一个实施方式中，核酸探针具有选自由以下组成的组中的核苷酸序列：[0013]a能够在严格条件下与图1所示序列ZICl或图2所示序列GHSR杂交的多核苷酸序列；[0014]b与a的多核苷酸具有至少70%同一性的多核苷酸；[0015]c与a的多核苷酸互补的多核苷酸；以及[0016]d包括a或b的多核苷酸的至少15个碱基的多核苷酸。[0017]在本发明的本方法中进一步优选确定ZICl和GHSR基因两者的甲基化。[0018]本发明的另外部分是ZICl和或GHSR作为检测HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌或肛门生殖器癌症及其高级别癌变前病变的分子诊断标志物的用途。优选地，在这样的用途中，所述标志物的甲基化预测所述病变或癌的发生.[0019]本发明还包括在检测HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌或肛门生殖器癌症及其高级别癌变前病变的方法中使用的零件的试剂盒，所述试剂盒包括：[0020]用于检测ZICl和或GHSR甲基化的装置，其中所述装置包括对于图1的ZICl核苷酸序列和或图2的GHSR核苷酸序列特异性的探针和或引物，以及[0021]用于检测HPV感染的装置，其中所述装置包括对于HPV特异性的探针和引物。附图说明[0022]图1显示了ZIC15调控区和编码序列。转录起始用粗斜体下划线指示，CpG岛用灰色上阴影并且编码序列为大写。[0023]图2显示了GHSR5调控区和编码序列。转录起始用粗斜体下划线指示，CpG岛用灰色上阴影并且编码序列为大写.[0024]图3显示了原代角质形成细胞、hrHPV永生化角质形成细胞和宫颈癌细胞系中，通过定量甲基化特异性PCR测量的ZICl和GHSR水平的箱形图。在y轴上，呈现了甲基化DNA的水平;在X轴上，根据转化程度原代角质形成细胞、早期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞、晚期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞和宫颈癌细胞将细胞系分组。ZICl和GHSR的甲基化水平随转化阶段而增加，并且与原代角质形成细胞和早期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞相比，ZICl和GHSR的甲基化水平在晚期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞和宫颈癌细胞中显著增加。指示了细胞类别之间甲基化水平的显著差异。[0025]图4显示了宫颈组织样本中，通过定量甲基化特异性PCR测量的ZICl和GHSR水平的箱形图。在y轴上，呈现了甲基化DNA的水平;在X轴上，针对每个疾病阶段和组织型将样本分组。ZICl和GHSR的甲基化水平随疾病阶段而增加，并在几乎所有SCC和AdCA中都被检测至IJ。指示了疾病类别之间甲基化水平的显著差异。[0026]图5显示了未患有宫颈疾病的女性包括HPV阴性刮擦物和HPV阳性刮擦物两者）、患有CIN3的女性、患有SCC的女性和患有AdCA的女性的宫颈刮擦物中，通过定量甲基化特异性PCR测量的ZICl和GHSR的水平的箱形图.在y轴上，呈现甲基化DNA的水平;在X轴上，针对疾病阶段和组织型将样本分组。ZICl和GHSR的甲基化水平随着疾病阶段而增加，并在所有SCC和AdCA中都被检测到。指示了疾病类别之间甲基化水平的显著差异。[0027]图6显示了患有子宫内膜癌的女性的宫颈刮擦物中，通过定量甲基化特异性PCR测量的GHSR的水平的箱形图。在y轴上，呈现甲基化DNA的水平;在X轴上，将样本分组为未患有宫颈疾病的女性的刮擦物和患有子宫内膜癌的女性的刮擦物。与对照相比，在几乎所有患有子宫内膜癌的女性中GHSR甲基化水平都显著增加.[0028]图7显示了患有宫颈癌的女性的尿样本中，通过定量甲基化特异性PCR测量的ZICl㈧和GHSR⑻的水平的箱形图和ROC曲线.左图：在y轴上，呈现甲基化DNA的水平;在X轴上，样本被分组为对照女性的尿n=20和患有宫颈癌的女性的尿η=16。与对照相比，在患有宫颈癌的女性中ZICl和GHSR甲基化水平显著增加。右图中的ROC曲线显示癌症患者与对照之间的突出的区别，其中ZICl的AUC为0.994，而GHSR的AUC为1.0。具体实施方式[0029]术语“HPV诱导的浸润性癌”是指由侵入周围组织的高风险HPV诱导的癌.这包括所有HPV诱导的癌组织型，S卩，在比如宫颈、口腔、口咽、肛门、直肠、阴茎、外阴、阴道等相关器官中的鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌和神经内分泌癌。这尤其包括头颈部鳞状细胞癌HNSCC、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌。[0030]术语“浸润性宫颈癌”是指侵入周围组织的宫颈癌。这包括所有的癌组织型，S卩，鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞状细胞癌和神经内分泌癌。[0031]术语“非HPV诱导的妇科癌症或肛门生殖器癌症”是指HPV阴性的子宫内膜癌、卵巢癌、夕卜阴癌、阴道癌、肛门癌和阴莖癌。[0032]术语“癌前病变”和“前期病变”是指多阶段细胞进化至癌症中进展为癌的机会大大增加的阶段.利用经典的形态，病理学家无法预测个体患者中哪些病变将进展或退化。本专利涉及可以预测浸润性癌症或其高级别前期病变的方法。[0033]术语“高级别癌前宫颈病变”是指多阶段细胞进化至宫颈癌中进展为宫颈癌的机会大大增加的阶段。术语“能够与......特异性杂交”是指能够与互补核酸序列特异性碱基配对并与之结合而形成核酸双链体的核酸序列。[0034]“补体”或“互补序列”是根据Watson-Crick碱基配对规则与另一个核苷酸序列形成氢键键合的双链体的核苷酸序列。例如，5-AAGGCT-3的互补碱基序列是3-TTCCGA-5。[0035]术语“严格杂交条件”是指影响杂交体稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。根据经验优化这些条件，以使引物或探针与其靶核酸序列的特异性结合最大化而使非特异性结合最小化。所使用的术语包括涉及这样的条件，在该条件下探针或引物将与其靶序列杂交达到比其他序列可检测地更大程度例如，至少2倍于本底的程度）。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同.较长的序列在较高温度下特异性杂交。大体上，在限定的离子强度和PH下，严格条件被选择为比特定序列的热熔点Tm低约5°C。!》是在限定的离子强度和pH下）50%的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度。通常，严格条件将是这样的条件，其中盐浓度为小于约I.OMNa离子浓度，通常约0.OlM至I.OMNa离子浓度或其他盐），pH为7.0至8.3，并且对于短探针或引物例如10至50个核苷酸温度是至少约30°C，而对于长探针或引物例如大于50个核苷酸是至少约60°C.严格条件也可以用加入去稳定剂（比如甲酰胺来实现.示例性的低严格条件或“严格度降低的条件”包括在37°C下，30%甲酰胺、IMNaCl、1%SDS的缓冲溶液中杂交，并在40°C下，2xSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37°C下，50%甲酰胺、IMNaCl、I%SDS中杂交，并在60°C下，0.IxSSC中洗涤.杂交程序是本领域熟知的，并在描述在例如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnffileySonsInc.，1994中。[0036]术语“寡核苷酸”是指通过磷键例如磷酸二酯、烧基磷酸酯和芳基磷酸酯、硫代磷酸酯）或非磷键例如肽、氨基磺酸酯等连接的短核苷酸单体的序列（通常6至100个核苷酸）。寡核苷酸可以含有具有修饰的碱基例如5-甲基胞嘧啶和修饰的糖基例如，2-0-甲基核糖基、2-0-甲氧基乙基核糖基、2氟核糖基、2氨基核糖基等）的修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是天然存在的或合成的双链和单链DNA分子以及具有环状、分支或线性形状的双链和单链RNA，并且可选地包括能够形成稳定的二级结构例如茎-环和环-茎-环结构）的结构域。[0037]如本文使用的术语“引物”是指能够退火为扩增靶的寡核苷酸，该扩增靶允许DNA聚合酶附接，从而当放置在其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下（即，在核苷酸和用于聚合的试剂（比如DNA聚合酶的存在下，且在合适的温度和pH下）时，起到DNA合成的引发点的作用。为了最大扩增效率，（扩增）引物优选为单链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以，在用于聚合的试剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物来源。如本文使用的，“双向引物对”是指DNA扩增，比如聚合酶链式反应PCI?扩增领域中，通常使用的一个正向引物和一个反向引物。[0038]术语“探针”是指将识别并与靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列形成氢键键合的双链体的单链寡核苷酸序列.[0039]DNA甲基化是对于高等生物的正常发育非常重要的生物化学过程。其涉及在胞嘧啶嘧啶环的5位或腺嘌呤嘌呤环的6位氮上添加甲基。在胞嘧啶的5位上的DNA甲基化具有减少基因表达的特定效果，并且已经在每个检查的脊椎动物中发现.在成熟体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸环境中.[0040]对宫颈组织样本和HPV永生化细胞系使用全基因组的DNA甲基化筛查，现已发现编码Zic家族成员1还称为ZICl;Genbank登录号NM_003412的基因和编码生长激素促泌素受体还称为GHSR;Genbank登录号NM_198407的基因在由全长HPV16和HPV18永生化的原代角质形成细胞中以及在CIN3病变和宫颈癌中，被DNA甲基化靶向，并且ZICl和GHSR启动子甲基化是hr-HPV诱导的癌发生的重要决定因素。因此，ZICl和GHSR基因组调控序列提供了诊断浸润性宫颈癌及其高级别前期病变的有价值的标志物。另外，本发明适用于诊断非宫颈hrHPV相关的浸润性癌症及其高级别前期病变。此外，GHSR甲基化另外适用于诊断子宫内膜和其他非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症.[0041]宫颈癌几乎排他性地与人乳头状瘤病毒HPV感染有关。如通过DNA序列变化所鉴定的，人乳头状瘤病毒构成超过150种类型的病毒的组.各种HPV引起各种皮肤和粘膜疾病.基于HPV诱导感染的细胞中恶性变化的能力，HPV大体上被分为低风险型和高风险型。低风险型HPV，比如1、2、4、6、11、13和32主要与良性病变或普通疣相关，而高风险型，比如16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68主要与恶化病变前和恶性上皮病变有关.已发现高风险型HPV导致子宫颈浸润性癌，以及肛门生殖道和或头颈部其他地方的浸润性癌症。因此，本发明不仅适用于检测浸润性宫颈癌及其前期阶段，还适用于检测由HPV，特别是高风险型HPV诱导的其他浸润性癌和相应的前期阶段。因此，本发明提供了用于对任何HPV诱导的高级别癌前病变或浸润性癌进行风险测定的方法。[0042]在本发明的上下文中，非常合适的HPV诱导的前期病变和浸润性癌是宫颈癌变前病变和浸润性宫颈癌，还有在比如口腔、口咽、肛门、直肠、阴茎、外阴、阴道等的其他组织中由高风险HPV诱导的前期病变和浸润性癌。[0043]如上所述，GHSR标志物还能够检测非HPV诱导的前期病变和浸润性癌。在本发明的上下文中，这样的癌症优选是HPV阴性的子宫内膜癌、卵巢癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌和阴莖癌.[0044]测试细胞可以是（前赘生性细胞、增殖宫颈细胞或任何其他细胞，在该测试细胞中要检测具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的存在。[0045]ZICl基因编码48kDa蛋白质，该蛋白质起到转录因子的作用并且是C2H2型锌指蛋白质的ZIC家族的成员。在发育期间，该家族的成员是重要的。ZICl参与神经发生。其在CNS的器官发生早期以及在背侧脊髓发育和小脑成熟期间发挥重要的作用（由Grinberg和Milien，ClinGenet.2005,67⑷：290-6综述）。已经描述了在结直肠癌症、胃癌症、卵巢癌和肝细胞癌症中ZICl超甲基化Gan等，PLoSOne·2011，62:el61616;Wang等，BiochemBiophysResCommun.2009,379⑷：959_63;Huang等，Epigenetics.2013,86:624-34;Wang等，TumorBiol.2014,35⑻：7429-33。已经提到了它是在原位癌和宫颈拭子中癌症的超甲基化基因筛查中发现的因素之一Wang等，CancerMed.2015,4l:43-55，但仅仅是作为超过2200个基因中的一个。[0046]GHSR基因编码作为G-蛋白偶联受体家族成员的41kDa蛋白质。编码的蛋白质可以在能量稳态和体重调控中发挥作用Howard等，Science1996,2735277:974-7。已经描述了在肺、乳腺、前列腺、胰腺、结直肠、成胶质细胞瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病的癌症中的GHSR超甲基化Moskalev等，Oncotarget2015,66:4418-27。尽管它已被定性为泛癌症标志物，但尚未公开与HPV诱导的癌症有联系.令人惊讶的是，在其他癌症类型中发现的这种标志物似乎也是HPV诱导的癌症的标志物。在通常由hrHPV引起的头颈部鳞状细胞癌⑽SCC的研究中已发现，HPV诱导的HNSCC和与HPV不相关的HNSCC的甲基化谱中存在差异Sartor等，2011，Epigenetics66:777-787。这在其他研究中得到认可，其中，例如，Colacino等（2013PLOS0ne，8l:E54742表明SPDEF、RASSF1、STAT5A、MGMT、ESR2、JAK3*HSDl7B12的超甲基化与HPV阴性HNSCC显著相关。类似地，KostarelIi等（J.ClinInvestigation，2013,1236:2488-2501显示与正常粘膜相比，在HPV阴性HNSCC中八0!1^2、？1^?4、60陬、051?2、？1?01和¥1?1的甲基化显著增加，而在册¥诱导的顯50：中这些基因没有显示超甲基化。如在口咽癌症中研究的CDKN2A甲基化仅仅在HPV阴性癌症中被检测到并且在HPV阳性癌症中不存在Taioli等，2009，BMCCancer，9:e354。在外阴癌中，HPV诱导的癌症也与那些与HPV无关的癌症例如，与硬化性苔藓LS相关的外阴癌之间的甲基化模式不同（Guerrero等，2010，IntJCancer28:2853-2864。例如，发现RASSF2A仅仅在HPV阴性的与LS有关的外阴癌中是甲基化的。在HPV诱导的外阴癌中未检测到RASSF2A甲基化。[0047]本发明人现已证实了ZICl和GHSR启动子甲基化在鳞状细胞癌、腺鳞癌、腺癌和神经内分泌癌组织型的宫颈癌中以及在其高级别前期病变中都是常见事件。最令人感兴趣的是，本发明人已表明，ZICl和GHSR启动子的超甲基化可以在宫颈刮擦物样本中检测到，并且该特征能够预测高级别CIN病变或浸润性癌的存在.此外，ZICl和GHSR启动子甲基化可以在通过自采样收集的宫颈阴道样本中检测到，并且被发现与潜在的高级别CIN病变或浸润性宫颈癌的存在相关。更有利的是，还表明可以在尿样本中检测到ZICl和GHSR启动子甲基化。当然，这样的检测使获得样本的方法更快更不繁琐。[0048]ZIC1和GHSR启动子的超甲基化也都可以在HPV阳性和HPV阴性的外阴癌及其高风险前期病变中检测到。[0049]此外，GHSR甲基化适用于诊断子宫内膜癌和其他非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症.[0050]因此，本发明提供了用于检测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌、非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症比如子宫内膜癌的方法，所述方法包括检测细胞中ZICl和或GHSR基因的超甲基化，由此这样的超甲基化指示存在具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变和HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症，比如子宫内膜癌。[0051]受试者的测试细胞可以包括来自粘膜细胞样本的细胞，比如宫颈细胞，还有其他组织，比如口腔、口咽、阴茎、外阴、肛门、直肠、子宫内膜、卵巢以及其中要检测与HPV有关的前期病变或癌症或非HPV诱导的妇科癌症、肛门生殖器癌症或口咽癌症的其他组织。所有这样的样本都可以用作本发明方法中的样本。优选地，患者细胞的样本包括宫颈细胞或者肛门生殖器或口咽道的其他上皮细胞作为测试细胞。宫颈细胞可以例如作为组织学或细胞学样本呈现.细胞学样本包括常规宫颈涂片以及宫颈样本和通过自采样收集的宫颈阴道样本或阴道样本的薄层制备物。可选地，细胞可以呈现在尿样中。本发明相对于其他检测宫颈和邻近组织中癌症的已知方法尤其有利的测试细胞是从自样本获得的测试细胞。[0052]本发明的方法特别适用于检测由高风险HPV或由（女性肛门生殖道衍生的与ZICl和或GHSR相关的高级别癌变前病变和浸润性癌。检测具有浸润潜力的HPV诱导的高级别癌变前病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法可以包括测量ZICl和或GHSR启动子。[0053]图1显示了ZICl基因的富含CpG的启动子区域以及编码序列。[0054]图2显示了GHSR基因的富含CpG的启动子区域以及编码序列。[0055]在核酸（比如DNA上进行甲基化的检测。所使用的试剂通常是核酸（DNA探针或PCR引物或限制性核酸内切酶，优选甲基化敏感性限制性核酸内切酶，用于检测测试细胞DNA上的甲基的存在。[0056]可以原位直接检测测试细胞组分，或者可以在与试剂接触之前通过本领域技术人员已知的常用方法将测试细胞组分与其他细胞组分分离（参见例如“CurrentProtocolsinMolecularBiology”，Ausubel等1995,第四版,JohnWileyandSons;“ALaboratoryGuidetoRNA：Isolation,analysis,andsynthesis”，Krieg编辑），1996，Wiley-Liss;“MolecularCloning：Alaboratorymanual”，J.Sambrook，E.F.Fritsch.1989.三卷，第二片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress〇[0057]由于所呈现的示例显示ZICl启动子频繁的甲基化，因此期望直接确定ZICl基因是否是超甲基化的。类似地，也期望直接确定GHSR基因是否是超甲基化的。尤其，主要位于基因的5’调控区中，称为“CpG岛”的富含胞嘧啶的区域通常是未甲基化的。术语“超甲基化”包括在ZICl或GHSR基因序列例如ZICl或GHSR启动子，第一外显子和第一内含子序列，分别参见图1和图2中通常未甲基化的位置处的胞嘧啶的任何甲基化.DNA甲基化可以通过目前在科学研究中使用的以下测定法来检测：[0058]•甲基化特异性PCRMSP，其是基于亚硫酸氢钠与DNA的化学反应，使CpG二核苷酸的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶或UpG，之后进行常规PCR.然而，在该方法中甲基化的胞嘧啶不会被转化，并且引物被设计为与所感兴趣的CpG位点重叠，这使得人们能够确定甲基化状态是甲基化的或未甲基化的。[0059]•全基因组亚硫酸氢盐测序，也被称为BS-Seq，其是DNA甲基化的高通量基因组范围分析。其是基于此前描述过的对基因组DNA的亚硫酸氢钠转化，然后在下一代测序平台上进行测序。然后将所获得的序列与参比基因组重新比对，从而基于由未甲基化的胞嘧啶向尿嘧啶的转化导致的错配来确定CpG二核苷酸的甲基化状态。[0060]·HELP测试，其是基于限制性内切酶识别和切割甲基化的和未甲基化的CpGDNA位点的不同能力。[0061]·ChIP-on-chip测试，其是基于商业上制备的抗体结合于与DNA甲基化相关的蛋白（如MeCP2的能力。[0062]•限制性标记基因组扫描，一种复杂的且现今很少使用的测试，其是基于限制性内切酶对于甲基化的和未甲基化的CpG位点的不同识别；该测试与HELP测试中的构思相似。[0063]•甲基化的DNA免疫沉淀MeDIP，类似于染色质免疫沉淀，免疫沉淀被用于分离甲基化的DNA片段，将其输入至IjDNA检测方法如DNA微阵列MeDIP-chip或DNA测序MeDIP-seq中。[0064]•亚硫酸氢盐处理的DNA的焦磷酸测序。这是由正常正向引物制备的扩增子的测序，而不是为了针对PCR选择基因由生物素化的反向引物制备的扩增子的测序。焦磷酸测序仪Pyrosequencer然后根据使用者给出的序列通过使DNA变性并同时向混合物中加入一种核苷酸来分析样本。如果存在错配，则记录下来并注意针对该错配存在的DNA的百分比。这为使用者提供了每个CpG岛的甲基化百分比。[0065]•用于DNA腺噪呤转甲基酶活性的分子刹车光测试molecularbreakIightassay-依赖于限制性内切酶DpnI对于用焚光团和淬灭剂标记的寡核苷酸中完全甲基化的腺嘌呤甲基化GATC位点的特异性的测试。该腺嘌呤转甲基酶使寡核苷酸甲基化，从而使其成为DpnI的底物.通过DpnI切割寡核苷酸导致了荧光增加。[0066]•甲基敏感的DNA印迹，类似于HELP测试，但使用了DNA印迹技术，利用限制性酶切探测甲基化中的基因特异性不同。这种技术用于评估探针的结合位点附近的局部甲基化。[0067]•基于量子点的甲基化测定法，一种如Bailey，V.等GenomeRes.19:1455-1461，2009所述的测定法，其中结合了MSP的高特异性和量子点FRETQD-FRET技术的高灵敏性和简便性（Zhang，C·等，2005，Nat·Mater·4:826-831。[0068]•使用纳米芯片技术进行DNA甲基化检测。该技术能够以高灵敏性和特异性检测最少量临床材料中的DNA甲基化，而不需要亚硫酸氢盐转化和PCR扩增.Shim，J.等Sci.Rep.3:1389,2013描述了使用固态纳米孔的方法。在专利公开W02009104967A1中描述了用于芯片上实验室技术的装置。[0069]超甲基化优选可以通过限制性核酸内切酶处理ZICl或GHSR多核苷酸基因）和DNA印迹分析来检测。可以使用包括CG作为其识别位点的部分并且在当C被甲基化时被抑制的任何限制性核酸内切酶。单独使用或组合使用的甲基化敏感性限制性核酸内切酶，比如BssHII、MspI、NotI或Hpal1是这样的内切核酸酶的示例。其他甲基化敏感性限制性核酸内切酶对于本领域技术人员来说将是已知的。[0070]测试甲基化的序列的可选的优选方式是甲基化特异性PCR其也基于DNA的亚硫酸氢盐修饰），然后是靶向富含CpG序列的特异性PCR反应。[0071]检测甲基化的序列并区分甲基化的DNA和未甲基化的DNA的第三种优选手段是基于纳米技术。[0072]为了本发明的目的，可以使用对ZICl或GHSR特异性的核酸探针来使用核酸探针）检测生物流体或组织中ZICl或GHSR多核苷酸的存在。基于ZICl或GHSR序列中的任何编码序列区和调控序列区的寡核苷酸引物可用于例如通过PCR扩增DNA。[0073]当使用PCR引物、核酸探针或限制性核酸内切酶时，分析ZICl或GHSR序列的5调控区、第一内含子序列和编码序列分别如图1和图2中指定的）。[0074]可以使用含有可检测量的ZICl或GHSR多核苷酸的任何样本。用于根据本发明的方法测试的优选样本包括这样的样本，比如（宫颈或阴道刮擦物、宫颈阴道灌洗物或拭子、尿、血液和或（宫颈活组织检查等。尽管受试者可以是任何哺乳动物，但优选受试者是人。[0075]用于检测病症的诊断方法包括其中提供用于测试的样本的方法，该样本包括来自宫颈或其他组织的细胞制备物。优选地，这样的样本被提供为涂片或其他细胞学样本。其他合适的样本包括尿和血液。[0076]该自样本可以用于检测标志物中启动子甲基化的变化，如果在医生获得的样本中可以实现相同的检测的话，该标志物中启动子甲基化的变化可靠地预测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的风险，或该HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的存在并不明显。[0077]自样本和医生采取的宫颈刮擦物具有不同的细胞组成，其由从宫颈病变剥落的指示细胞相对于正常细胞的不同分数来反映，在自样本的情况下该正常细胞大部分为阴道细胞。因此，在自样本中可以看到阴道细胞和宫颈指示细胞更随机的分布。已知自样本中主要为较低比例的超甲基化阳性宫颈指示细胞影响对这些样本的细胞形态学和分子测试的表现。这得到了文献数据的支持，该文献数据表明细胞学检测异常细胞的细胞形态学分析）不能可靠地在自采样的材料上进行Nobbenhuis等，J·Chin·Pahtol·55:435，2002;Garcia等，ObstetGynecol102:266_272,2003。[0078]此外，描述通过测定宿主细胞基因的DNA甲基化水平针对超甲基化的指示细胞非存在如图直接比较自样本和医生采取的刮擦物的研究表明，相比于宫颈刮擦物，自样本中检测CIN3的灵敏性较低：[0079]-Chang，BMCCancerl5:418,2015,他在图2中表明通过对自样本进行甲基化分析比刮擦物检测到更少的CIN3;[0080]-Luttmer等，BrJCancer2016年7月14日.doi:10.1038bje.2016.200,其中显示FAMl9A4甲基化分析的CIN3灵敏性，在自样本中为78.4%，在刮擦物中为88.2%;[0081]-Boers等，BrJCancer111:1095-1101，2015,他们表明JAM3的CIN3+灵敏性在自样本中为71%，在刮擦物中为82%。[0082]此外，自样本中的总体甲基化水平比率与相应的医生采取的刮擦物相比通常较低（由Boers等在图3中针对hTERT更清楚地显示）。[0083]总之，1自样本的细胞学分析以检测CIN3的不可靠性，2与医生采取的刮擦物相比，使用自样本进行甲基化分析用于检测CIN的较低的灵敏性，以及3与医生采取的刮擦物相比，在自样本中发现的较低的甲基化水平，都指示与医生采取的刮擦物相比，自样本中不同的细胞组成和较低的指示细胞的分数。[0084]因此，令人惊讶的是，当对自样本进行测定时，ZICl和或GSHR启动子的超甲基化为检测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症提供了可靠的测量。除了它们的高特异性之外，它们还能够检测所有的（100%宫颈癌。[0085]另外，样本可以来源自尿样本。如实施例8所示，已经显示检测尿样本中的超甲基化是可行的。这在那些难以获得宫颈样本的情况中当然是非常有利的。[0086]获自哺乳动物优选人的细胞或组织样本被适当地预处理，以允许将包括在所述样本中的测试细胞的细胞DNA与试剂之间接触，该试剂检测ZIC1或GHSR并且检测与可比较的正常细胞相比ZICl或GHSR基因的甲基化的改变。样本可以固定在合适的载体上，以允许观察个体细胞。众所周知的载体材料的示例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯，该载体材料可选地提供有改善样本的粘附和固定的层，比如聚-L-赖氨酸或硅烧的层。宫颈涂片或活组织检查可以例如按照本领域技术人员已知的PapanicoIaouPap测试或其任何合适的修改来制备，并且可以通过允许试剂适当地接近目标组分的程序来固定。在本发明的某些实施方式中，细胞学样本被提供为宫颈细胞的常规涂片样本或薄层制备物或者液体基的细胞学样本或本领域技术人员已知的任何其他种类的制备物.如果需要储存，常规程序使用福尔马林缓冲液用于固定，然后进行石蜡包埋，这提供保存完好的组织基础结构。[0087]在本发明方法的一个实施方式中，与可比较的正常细胞相比，检测到测试细胞中ZICl和或GHSR启动子的增加的甲基化.[0088]本发明还提供了如权利要求书中限定的零件的试剂盒，用于检测受试者的测试细胞中与ZICl和或GHSR相关的具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法。这样的试剂盒可以合适地包括采取（宫颈刮擦物的刷子或抹刀以及装有收集测试细胞的收集介质的容器。可选地，将包括由冲洗注射器、一次性女性尿导管和具有冲洗液的容器组成的采样装置以通过宫颈阴道灌洗来收集宫颈细胞。另外，用于收集尿的容器被合适地，优选地用于收集首段尿。根据本发明的试剂盒可以包括用于检测ZICl和或GHSR启动子甲基化的引物和探针。[0089]根据本发明的零件的试剂盒包括用于检测ZICl和或GHSR启动子甲基化的工具，比如甲基化敏感性限制酶，或能够与图1和或图2的核苷酸序列杂交的探针或引物。[0090]在本发明试剂盒的又另一个可选实施方式中，用于检测ZICl和或GHSR启动子甲基化的工具可以与用于检测HPV感染优选用于检测高风险型的HPV感染）的工具结合。这样的工具可以包括HPV特异性引物或探针、HPV感染的蛋白质标志物或甚至本领域已知的HPV感染的替代标志物。[0091]现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。[0092]实施例[0093]实施例1、在HPV诱导的转化中ZICl和GHSR作为甲基化目标的探索[0094]已通过连续传代的HPV16和HPV18永生化角质形成细胞以及宫颈组织样本的MBD测序的方式对与HPV诱导的体外转化和体内宫颈癌发生相关的全基因组DNA甲基化变化进行了全面分析。包括的细胞培养物是2个原代人包皮角质形成细胞的DNA分离物，10个用全长HPV16和HPV18DNA转染的角质形成细胞的DNA分离物（不同传代的细胞系FK16A、FK16B、FK18A、FK18B;Steenbergen等，Oncogene1996，136:1249-57，2个用HPV16E6E7转导的角质形成细胞的DNA分离物（Steenbergen等，J.Pathology2013;231I:53-62和宫颈癌细胞系SiHa。包括的宫颈组织样本由10个癌、12个高级别宫颈上皮内瘤变CIN23和3个低级别宫颈上皮内瘤变CINl组成。[0095]MBD测序方法基于使用甲基结合结构域进行CpG甲基化片段的富集，然后进行大规模平行测序Serre等，NucleicAcidsRes.2010;382:391-9。通过将这些片段映射到参照基因组，可以确定推定甲基化的基因座.[0096]通过这种途径，我们将ZICl和GHSR鉴定为HPV诱导的体外转化和体内宫颈癌发生中的新型甲基化目标。[0097]通过在原代角质形成细胞、早期传代和晚期传代的HPV16和HPV18永生化角质形成细胞以及宫颈癌细胞系中的定量甲基化特异性PCRqMSP来验证ZICl和GHSR启动子区域的甲基化。表1中列出了qMSP的引物和探针。看家基因β-肌动蛋白（ACTB被选作总DNA输入测量的参考。使用比较性Ct方法进行定量（Schmittgen等，NatProtoc2008,3:1101-1108〇ZICl和GHSR的甲基化水平随着转化阶段而增加，并且与原代角质形成细胞和早期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞相比，晚期传代HPV16和HPV18永生化角质形成细胞和宫颈癌细胞中的ZICl和GHSR的甲基化水平显著增加图3。[0098]实施例2:ZICl和GHSR启动子甲基化是高级别CIN病变、宫颈鳞状细胞癌、腺鳞癌、腺癌和神经内分泌癌中的常见事件[0099]接下来，我们通过qMSP分析了宫颈组织样本中的ZICl和GHSR启动子甲基化。测试的组织样本包括30个正常的宫颈对照样本、13个CINl病变、29个CIN3病变和24个宫颈鳞状细胞癌（SCC。看家基因β-肌动蛋白（ACTB被选作总DNA输入测量的参考。使用比较Ct方法进行定量Schmittgen等，NatProtoc2008，3:1101-1108。我们发现与正常和CINl病变相比，CIN3病变和SCC中ZICl启动子甲基化显著增加。此外，与CIN3病变相比，SCC中的甲基化水平显著增加（图4A。在产生90%特异性的阈值设置下，几乎所有96%SCC和79%的CIN3病变针对ZICl甲基化呈阳性.除宫颈鳞状细胞癌之外，我们还分析了宫颈腺癌中ZICl启动子甲基化.构成高达20%的宫颈癌的腺癌特别令人感兴趣，因为在全国范围的宫颈筛查项目中宫颈腺癌的发病率保持不变或甚至增加。这指示宫颈腺癌及其腺体前期病变（即原位腺癌ACIS常常被基于细胞学的筛查漏诊。基于宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌之间的比较遗传学和表观遗传学研究，已经发现两种肿瘤组织型均通过不同的致癌途径发育Dong等，2001，Kang等，2005,Wilting等，2006，Henken等，2007。所以，能够检测宫颈鳞状细胞癌的大多数生物标志物不一定检测到宫颈腺癌。[0100]令人感兴趣的是，Zici启动子甲基化似乎是与大多数已知标志物相反的一个例夕卜，因为ZICl甲基化水平除了在一个86%测试的AdCa中以外全部都是增加的（图4A。对于宫颈腺鳞癌和神经内分泌癌已经获得了类似的结果。[0101]因此，Zici启动子甲基化似乎是所有宫颈癌组织型的通用甲基化标志物。[0102]与正常和CINl病变相比，GHSR启动子甲基化的分析显示CIN3病变、SCC和AdCa中的甲基化水平显著增加。此外，与CIN3病变相比，SCC中的甲基化水平显著增加（图4B。在产生90%特异性的阈值设置时，所有（100%SCC、所有（100%AdCa和69%的CIN3病变对GHSR甲基化呈阳性。因而，GHSR启动子甲基化也表示所有宫颈癌组织型的通用甲基化标志物.[0103]实施例3、hrHPV阳性宫颈刮擦物中ZICl和GHSR启动子甲基化的检测[0104]从参与基于人群的筛查的女性中，我们研究了诊断为CIN3的hrHPV阳性女性η=56和最高诊断为CINl的hrHPV阴性和阳性女性分别是η=40和η=87的宫颈刮擦物。另夕卜，对诊断患有宫颈SCCη=23和AdCaη=3的女性的宫颈刮擦物进行了测试。这些女性的宫颈刮擦物收集在其中核酸保存良好的保存介质中。[0105]与HPV阴性和HPV阳性对照相比，患有CIΝ3、SCC和AdCa的女性的刮擦物中ZIC1甲基化显著增加。与患有CIN3的女性相比，患有SCC的女性的刮擦物中甲基化水平也显著增加图5A。在产生90%特异性的阈值设置时，所有（100%女性SCC和AdCa刮擦物呈阳性，并且56%的CIN3病变测试ZICl甲基化呈阳性。在70%特异性时，检测到86%的CIN3病变。[0106]与HPV阴性和HPV阳性对照相比，患有CIN3、SCC和AdCa的女性的刮擦物中的GHSR甲基化显著增加。与患有CIN3的女性相比，患有SCC的女性的刮擦物中的甲基化水平也显著增加（图5B。在产生90%特异性的阈值设置时，所有（100%女性SCC和AdCa的刮擦物呈阳性，并且58%的CIN3病变对GHSR甲基化测试呈阳性。在70%特异性时，检测到80%的CIN3病变。目前的数据指示，ZICl和GHSR甲基化分析都能够以高灵敏性和特异性检测宫颈刮擦物中潜在的宫颈疾病CIN3+。特别是在高特异性设置下，ZICl和GHSR两者都胜过其他已发表的甲基化标志物并检测所有癌症。[0107]由此，这些基因在通过初级HPV测试进行筛查时提供了有前景的分类标志物。[0108]实施例4:ZICl和GHSR启动子甲基化作为初级筛查的标志物[0109]到目前为止测试的甲基化标志物由于在对CIN23和癌症可接受的灵敏性下的特异性太低而不适用于初级筛查。例如，由04011、1^1^、1^1?-124和或?411944的各种组合组成的标志物或标志物组在CIN23的可接受的灵敏性70%和高达100%的宫颈癌检测下具有70%-75%的特异性。当评估使用ZICl和GHSR甲基化作为初级筛查的标志物时，令人惊讶地发现这两种标志物对于以极高特异性检测癌症都具有极高的灵敏性。在基于HPV阴性对照的100%特异性（和基于HPV阳性对照的90%特异性）下，ZICl甲基化检测到100%的SCC、100%的AdCa和55%的CIN3病变。[0110]在基于HPV阴性对照的95%特异性和基于HPV阳性对照的90%特异性下，GHSR甲基化检测到100%的SCC、100%的AdCa和57%的CIN3病变。因而，通过ZICl和或GHSR进行初级筛查能够以非常高的特异性95%-100%检测到几乎所有的宫颈癌。[0111]实施例5:自采样样本中ZICl和GHSR启动子甲基化[0112]我们随后分析了使用VibaBrushRoversMedicalDevices，奥斯，荷兰）或Delphi筛选器DelphiBioscienceBV，斯海彭泽尔，荷兰收集的自采样的宫颈阴道样本。就针对HPV测试而言，自收集的样本相当于医生采取的样本Brink等，JClinMicrobiol2006;44:2518-23。在该群体中，在自样本中测试hrHPV产生的彡CIN2病变至少与在匹配的响应者女性群体中通过常规筛查（Bais等，IntJCancer:2007，120:1505-1510;G8k等，BMJ2010;340:cl040发现的一样多。然而，对于HPV自采样，还需要分类工具将hrHPV阳性女性分为患有和未患有多CIN23和多原位腺癌的女性。虽然常规细胞学不能可靠地在自收集的宫颈阴道样本上进行Brink等，JClinMicrobiol2006;44:2518-23，DNA甲基化分析可应用于自收集的宫颈阴道灌洗物Eijsink等，GynecolOncol2011;120:280-3。重要的是，本发现显示甲基化标志物GHSR和ZICl不仅在应用于自收集的宫颈阴道灌洗样本时，而且在应用于自收集的阴道刷样本时也能够检测潜在的CIN2+。后者是其中先前已知的标志物通常表现为低临床灵敏性的样本类型。所以，ZICl和GHSR标志物可以被视为在医生采取的宫颈涂片、基于灌洗的自样本和基于刷子的自样本上表现相同的泛检测标志物。[0113]通过qMSP测试一系列20例hrHPV阳性女性的自收集的阴道刷样本后续中没有临床意义的疾病证据）以及25例hrHPV阳性女性的自收集的阴道刷样本具有异常的后续涂片和潜在病变彡CIN3的ZICl和GHSR启动子甲基化.几乎所有后来被诊断患有癌症的女性的自收集的阴道刷样本在70%的特异性下针对ZICl和GHSR甲基化测试呈阳性。另外，超过一半的后来被诊断患有CIN3的女性的自收集的阴道刷样本针对ZICl和GHSR启动子甲基化测试呈阳性。[0114]最令人感兴趣的是，对24例hrHPV阳性女性的自收集的宫颈阴道灌洗样本的分析显示，在高达100%的特异性下使用ZICl或GHSR甲基化分析检测到100%的癌。ZICl甲基化甚至在90%特异性下检测到70%的CIN3病变。与已知的应用于自收集的宫颈阴道灌洗样本的甲基化标志物（前面引用的文章：Chang，Boers等和Luttmer等，Eijsink等，GynecolOncol2011;120:280-3;Verhoef等，LancetOncol2014;15:315-22相比，自收集的宫颈阴道灌洗样本中ZICl的标志物潜力非常高.[0115]这些数据显示，对从自收集的阴道刷样本和自收集的宫颈阴道灌洗样本获得的自采样的材料的ZICl和GHSR启动子甲基化分析是非常可行的，并且将改进对潜在的高级别宫颈疾病的检测。最令人感兴趣的是，自收集的宫颈阴道灌洗样本的ZICl甲基化分析甚至适用于初级筛查在100%特异性下针对宫颈癌100%灵敏性）。[0116]实施例6:患有子宫内膜癌的女性的宫颈刮擦物中的GHSR启动子甲基化[0117]对总共24例患有子宫内膜癌的女性的宫颈刮擦物进行GHSR甲基化测试。与被诊断为最高CINl的hrHPV阴性和阳性女性的宫颈刮擦物分别为n=40和n=87相比，患有子宫内膜癌女性的GHSR甲基化水平显著增加（图6。在〜8%的对照测试呈阳性的特异性阈值设置下，检测到80%的子宫内膜癌._8]实施例7:HPV阳性和HPV阴性外阴癌及其高级别前期病变中的ZICl和GHSR启动子甲基化。[0119]像宫颈癌变前病变一样，大多数外阴癌变前病变外阴上皮内瘤变;VIN是由HPV感染引起的。只有一小部分病变有进展至外阴鳞状细胞癌（VSCC的增加风险。为了确定ZICl和GHSR甲基化是否可以将具有进展至癌症的高风险的病变与具有低癌症进展风险的病变相区分，通过qMSP分析以下组织样本：[0120]正常外阴组织n=8;从小阴唇获得的对照外阴组织）、在后续至少10年期间不发展VSCC的女性的HPV阳性VIN病变η=15;具有进展至癌症的低风险的病变）、患有VSCC女性的HPV阳性VIN病变η=15;具有进展至癌症的高风险的病变和外阴鳞状细胞癌VSCC;n=50;包括38个HPV阴性和12个HPV阳性癌症）。[0121]与未患有VSCC的女性的HPV阳性VIN相比，患有VSCC的女性的HPV阳性VIN病变中ZICl和GHSR的甲基化水平均显著增加。此外，与VSCC相关的VIN病变中的甲基化水平与在VSCC中检测到的甲基化水平类似。这指示ZICl和GHSR甲基化可用于HPV诱导的外阴癌变前病变的风险测定。[0122]实施例8:宫颈癌患者的尿样本中的ZICl和GHSR启动子甲基化[0123]鉴于在尿中进行HPV测试已显示对宫颈刮擦物的HPV测试的有前途的可替换方案Pathak等，BMJ2014;349:g5264，我们评估了尿中甲基化标志物检测是否能够检测出宫颈癌。[0124]对此我们分析了从16名宫颈癌患者收集的尿样本和20个年龄匹配的女性对照的尿样本中的ZICl和GHSR甲基化。[0125]如图7所示，发现与对照相比，宫颈癌患者中GHSR和ZICl甲基化水平均显著增加p〇.01。接受者操作曲线ROC分析得出ZICl的曲线下面积AUC为0.994，而GHSR为1.0。这指示对尿的ZICl和GHSR甲基化分析适用于初级筛查。[0126]表1用于ZICl和GHSR定量MSP分析的引物和探针序列5-30

权利要求：1.一种用于检测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌以及非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症的方法，所述方法包括检测细胞中GHSR和或ZICl基因的超甲基化，由此这样的超甲基化指示存在具有浸润潜力的HPV诱导的前期病变、HPV诱导的浸润性癌和非HPV诱导的妇科癌症和肛门生殖器癌症。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HPV诱导的高级别癌变前病变或HPV诱导的浸润性癌是高级别癌前宫颈病变或浸润性宫颈癌.3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述HPV诱导的浸润性癌是高风险HPV诱导的浸润性癌.4.根据权利要求1所述的方法，其中所述非HPV诱导的妇科癌症是子宫内膜癌。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述超甲基化在如图1和图2所示的富含CpG序列中检测。6.—种根据权利要求1-5中任一项检测HPV诱导的高级别癌变前病变和HPV诱导的浸润性癌以及非HPV诱导的妇科癌症或肛门生殖器癌症的方法，其中所述超甲基化是与可比较的正常细胞相比，测试细胞中GHSR和或ZICl的富含CpG启动子和或基因序列中增加的甲基化。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中试剂是选自由BssHII、MspI、NotI和HpaII组成的组中的甲基化敏感性限制性核酸内切酶。8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法涉及纳米技术，优选芯片上实验室技术。9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中进行甲基化特异性PCR，其基于DNA的亚硫酸氢盐修饰，然后进行靶向富含CpG序列的特异性PCR反应。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂是与如图1或图2所示的核酸结合的核酸探针或引物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸探针或引物具有可检测的标记。12.根据权利要求9、10或11所述的方法，其中所述核酸探针具有选自由以下组成的组中的核苷酸序列：a能够在严格条件下与图1所示的序列ZICl或图2所示的序列GHSR杂交的多核苷酸序列；b与a的多核苷酸中的一种具有至少70%同一性的多核苷酸；c与a的多核苷酸中的一种互补的多核苷酸；以及d包括a或b的多核苷酸中的一种的至少15个碱基的多核苷酸。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中确定所述GHSR和ZICl基因的所述甲基化。14.GHSR和或ZICl作为用于检测HPV诱导的高级别癌变前病变或HPV诱导的浸润性癌或非HPV诱导的妇科癌症或肛门生殖器癌症的分子诊断标志物的用途，优选地其中所述标志物的甲基化预测所述病变、癌或癌症的发生。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞来源于尿样本或宫颈样本。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述宫颈样本是自样本。17.在检测HPV诱导的高级别癌变前病变或HPV诱导的浸润性癌或非HPV诱导的妇科癌症或肛门生殖器癌症的方法中使用的零件的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测GHSR和或ZICl甲基化的装置，其中所述装置包括对于图1的ZICl核苷酸序列和或图2的GHSR核苷酸序列特异性的探针和或引物；用于检测HPV感染的装置，其中所述装置包括对于HPV特异性的探针和引物。

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