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申请/专利权人：中国科学院天津工业生物技术研究所

摘要：本发明涉及一种脱氢表雄酮新的制备方法，属于甾族化合物制备方法，其特征在于5‑AD为底物，利用3β‑羟基甾体脱氢酶对3‑位羰基进行还原，得到脱氢表雄酮DHEA。该方法利用羰基还原酶即3β‑羟基甾体脱氢酶作为催化剂，能够实现3位羰基高度的区域选择性和立体选择性还原。

主权项：1.3β‑羟基甾体脱氢酶基因，其核酸序列分别为SEQ ID No.1,No.2,No.3,No.4,No.5。

全文数据：3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮DHEA技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种脱氢表雄酮DHEA的制备方法，利用3β-羟基甾体脱氢酶的高度区域选择性和立体选择性实现。背景技术作为甾体药物中的一种，DHEA经常被作为抗衰老药物来使用，因为人们认为体内DHEA含量的减少与一系列衰老相关的病症发病密切相关。有些文章显示，人在80岁的时候，其体内的DHEA含量只有25岁时候的110。人们通常认为，脱氢表雄酮硫酸酯DHEAS是DHEA的一种更稳定的存在形式。DHEA和DHEAS被认为是大脑中最重要的神经甾体BaulieuEE,SchumacherM.Progesteroneasaneuroactiveneurosteroid,withspecialreferencetotheeffectofprogesteroneonmyelination[J].Steroids,2000,6510-11:605-612。DHEA同时还是胆固醇代谢为性激素如睾酮等时关键的中间产物。近期的研究更是进一步的表明了神经甾体在加强记忆ShiJ,SchulzeS,LardyHA.Theeffectof7-oxo-DHEAacetateonmemoryinyoungandoldC57BL6mice[J].Steroids,2000,653:124-129，抵抗焦虑，抗痉挛KokateTG,SvenssonBE,RogawskiMA.Anticonvulsantactivityofneurosteroids-correlationwithgamma-aminobutyricacid-evokedchloridecurrentpotentiation[J].JPharmacolExpTher,1994,2703:1223-1229，抗抑郁，以及保护神经系统尤其保护其免受氧化剂伤害BastianettoS,RamassamyC,PoirierJ,etal.DehydroepiandrosteroneDHEAprotectshippocampalcellsfromoxidativestress-induceddamage[J].MolBrainRes,1999,661-2:35-41.和由外源物诱导突变所造成的DNA损害ShenS,CooleyDM,GlickmanLT,etal.ReductioninDNAdamageinbrainandperipheralbloodlymphocytesofelderlydogsaftertreatmentwithdehydroepiandrosteroneDHEA[J].MutatRes-FundamMolMechMutagen,2001,4801：53-62。除去DHEA本身的药用功能，作为甾体工业中的重要一分子，DHEA也是甾体工业中合成其他甾体药物的重要前体化合物。据文献报道，相比于DHEA，7α-OH-DHEA在防止体外神经元细胞缺氧死亡方面有着更高的活性，其抗氧化性也大大的加强。此外，羟基化之后的7α-OH-DHEA，其对肿瘤增生有着强烈的抑制作用李合平,梁冬松,戴贵馥,etal.7α-羟基-去氢表雄酮的合成与活性测定[J].中国药学杂志,2009,4320:1596-1598。于此类似7α，15α-OH-DHEA，和1α-OH-DHEA等经DHEA衍生合成出来的药物均有着特殊的药理作用，应用前景十分广泛。因此，DHEA作为甾体药物中的重要基础原料，其工业合成对整个甾体工业的发展有着重大的影响。1956年Rosenkranz等采用薯芋皂苷为初始原料成功的合成了DHEA，正式开启了DHEA合成的工业化时代。经薯芋皂苷配基合成DHEA的流程大同小异，其原理几乎一样只差别于各个步骤选择了不同的保护剂或氧化剂等。但是随着时代的发展，环境问题越来越成为制约社会和科技发展的重大问题。传统的DHEA的生产模式需要消耗大量的薯蓣皂素资源，而其基本上是由专门的耕地种植获得。此外，工业上在皂素资源的提取和裂解过程中会产生大量的废水以及其他污染物，使得该行业面临着巨大的环保压力。随着老龄化社会的到来，医用资源的消耗必将进一步扩大。这必将导致DHEA的生产面临着资源和环境的双重制约。因此开发新的工艺路线，以替代传统的生产工艺刻不容缓。伴随着生物技术的进步，生物技术在甾体工业上的应用越来越广泛。在面对资源压力和环境压力的情况下，现在采用微生物方法降解植物甾醇生产4-AD的工艺已经取得实质性的进展。国外以及国内的领先企业已经开始了工业化规模的发酵生产。该工艺以此前大量被丢弃和闲置的甾醇资源为原料，经过工程菌大量发酵，可大规模的生产甾体工业的基础类药物4-AD。而4-AD其既解决了大面积占用耕地的资源问题，也解决了环境污染问题。可以预见，随着更多此类工程菌的开发，以及更多企业采用此工艺方法。鉴于4-AD和DHEA结构的高度相似，本方法以5-ADII为底物，利用3β-羟基甾体脱氢酶还原3-位羰基制备DHEA。发明内容本发明提供了一种由5-AD制备DHEA的新方法。该发明的是利用3β-羟基甾体脱氢酶实现3-位羰基的还原从而制备DHEA。在合成过程中，3β-羟基甾体脱氢酶蛋白序列分别为No.6，No.7,No.8,No.9，No.10。在羰基还原酶的作用下，将3位羰基还原为β-羟基，从而制备脱氢表雄酮III的反应步骤如下：底物5-AD与溶剂、助溶剂构成反应体系，加入生物催化剂和辅酶循环体系进行反应，温度为25～40℃；时间为4～24小时，制备DHEA；直接利用发酵液转化，底物5-AD浓度为10gL～60gL；发酵液浓缩后，底物浓度可以达到120gL。上述的生物催化剂包括辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶和羰基还原酶，或者是粗酶粉。具体实施方式结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1全基因合成由上海旭冠公司完成。根据来源于Williamsiasp.1138的基因WP_084836793.1优化获得基因序列SEQNo.1、来源于Novosphingobiumtardaugens的基因WP_021689360.1优化后基因序列SEQNo.2、来源于Geobactermetallireducens的基因No.3、来源于Cupriavidussp.BIS7的基因WP_026035294.1优化后基因SEQNo.4。将基因构建到相应载体中。将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami中，构建分别表达了3β-羟基甾体脱氢酶SEQNo.5SEQNo.6、SEQNo.7、SEQNo.8以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好编号分别为Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4。以目的蛋白表达量不低于20％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。实施例2分别Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基蛋白胨10gL，酵母粉5gL，NaCl10gL，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基工业培养基，32℃，200rpm培养20h。分别取Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4的发酵液1mL超声破菌后，检测3β-羟基甾体脱氢酶的活力。3β-羟基甾体脱氢酶酶活定义：每分钟消耗1μmolNADPH所需要的酶量为1个酶活单位U；由于在还原过程中需要辅酶的再生，引入了葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。葡萄糖、甲酸脱氢酶的酶活定义：每分钟生成1μmolNADPH所需要的酶量为1个酶活单位U。经酶标仪检测，发酵液的3β-羟基甾体脱氢酶酶活达到数据如下表：编号Ec-1Ec-2Ec-3Ec-45AD酶活Uml3.53.53.93.3实施例3以5-AD为底物，分别取Ec-1，Ec-2,Ec-3,Ec-4的发酵液1mL，2-甲基四氢呋喃1mL，5-AD30mg，葡萄糖50mg，辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1mg，反应24小时后，EA等体积萃取，GC检测。实施例51L体系进行转化：D-葡萄糖80g，D-葡萄糖脱氢酶2g，NAD+0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD60g溶解于500mL2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约5h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品62g。实施例61L体系进行转化：甲酸钠40g，甲酸脱氢酶2g，NAD+0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD60g溶解于500mL2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约6h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品62g。实施例71L体系进行转化：D-葡萄糖160g，D-葡萄糖脱氢酶3g，NAD+0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD100g溶解于500mL2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约15h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品103g。实施例81L体系进行转化：甲酸钠80g，甲酸脱氢酶4g，NAD+0.1g，Ec-1或Ec-2或Ec-3或Ec-4的发酵液500mL，5-AD100g溶解于500mL2-甲基四氢呋喃中加入上述体系室温反应。GC检测反应进程至底物完全转化。约16h后，用EA萃取三遍反应液。有机相用无水硫酸钠干燥后旋干。获得DHEA粗品105g。序列表中国科学院天津工业生物技术研究所3β-羟基甾体脱氢酶制备脱氢表雄酮（DHEA）2017.10.308SIPOSequenceListing1.01774DNAWilliamsiasp.11381atgggtcgtctggaaggtaaaaccgctatcgttaccggtggtgctcagggtatgggttct60gctaccgttcgtgttatggttgaagaaggtgctaaagttgttatcgctgacctggctgaa120caggctggtaaatctctggctgctgaactgggtgacgctgcttctttctgccgtctggac180gtttcttctgaatctgactggcagaaagttctggctcacaccctggaagttcacggtacc240gttaacgttctggttaacaacgctggtatccagtacttcgttggtgttgaagacatcgaa300gctgaacgtgttatgcgtctgttctctatcaacgttctgggttctatgctgggtgttaaa360accgttgctccgatcatgaaaaaagctggtgctggtgttgttatcaacatctcttctctg420gacggtttccgtggtaccaacggtatgtctccgtacgttgcttctaaatgggctgttcgt480ggtctgaccaaagctcaggctctggaactgggtccggttatccgtgttgtttctgttcac540ccgggtggtgttaacaccccgatgggtaacccgaccggtgacaccggtgaagctctgaac600gctccgtacggtcgtgttccgctgcgtcgtatcggtgaaccgatcgaagttgctcgtgtt660accgctttcatggcttctgacgacgcttcttacgtttctggttctgaaatcgctgttgac720ggtggttggaccgctggtcactaccacgttggtctgccgggtggtccggaagct7742789DNANovosphingob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权利要求：1.3β-羟基甾体脱氢酶基因，其核酸序列分别为SEQIDNo.1,No.2,No.3,No.4,No.5。2.3β-羟基甾体脱氢酶，其蛋白质序列分别为SEQIDNo.7,No.8,No.9,No.10。3.制备脱氢表雄酮的方法，包括：分别将3β-羟基甾体脱氢酶SEQIDNo.7,No.8,No.9,No.10与底物5-AD相互作用，在适当地还原反应体系中，还原5-AD制备脱氢表雄酮DHEA。

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