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申请/专利权人：中国农业科学院作物科学研究所

摘要：本发明公开了蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用。所述蛋白质ZmVps29为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。所述籽粒性状为粒长，和或，粒宽，和或，粒长粒宽。实验证明，在野生型拟南芥中过表达ZmVPS29基因，得到转ZmVps29基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转ZmVps29基因拟南芥的粒长增加和粒长粒宽增加。实验还证明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29在培育籽粒性状优良和或植物产量高的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

主权项：1.蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状为d1）和或d2）和或d3）：d1）粒长粒宽；d2）粒长；d3）粒宽；所述蛋白质ZmVps29为a1）或a2）：a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2 在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

全文数据：蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用。背景技术玉米ZeamaysL.是世界上重要的粮食、饲料和工业原料三元作物。随着世界人口的增加，对于粮食的需求与日俱增，进而对一系列主要粮食作物的产量提出了更高的要求。在可耕地面积的持续减少的情况下，选育单产突出的玉米新品种是稳定和提高玉米总产量最经济有效的途径。玉米总产量受单位面积有效穗数、穗粒数和粒重三个因素的影响，三者关系的协调是取得玉米高产的关键。作为产量构成因子之一的粒重相对最稳定且受环境条件的影响相对较小，历来被育种者所重视，因此提高玉米粒重是玉米高产育种的重要途径之一。玉米籽粒性状如粒长，粒宽是决定粒重的重要因子。因此，寻找与玉米籽粒性状相关的蛋白质对培育玉米新品种具有重要的意义。发明内容本发明所要解决的技术问题是如何使植物籽粒性状更优和如何提高植物产量。为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状可为d1和或d2和或d3：d1粒长粒宽；d2粒长；d3粒宽。上述应用中，所述蛋白质ZmVps29可为a1或a2或a3：a1氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加得到的与植物籽粒性状和或植物产量相关的蛋白质。其中，序列表中序列2由188个氨基酸残基组成。为了使a1中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列上述a3中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加。上述a3中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和或进行一个或几个碱基对的错义突变，和或在其5′端和或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子在调控植物籽粒性状和或调控植物产量中的应用也属于本发明的保护范围；所述籽粒性状可为d1和或d2和或d3：d1粒长粒宽；d2粒长；d3粒宽。上述应用中，编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子可为如下b1或b2或b3或b4所示的DNA分子：b1编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；b2核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b3与b1或b2限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子；b4在严格条件下与b1或b2限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由567个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZmVps29的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ZmVps29的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZmVps29，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质ZmVps29的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比％表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述调控植物籽粒性状可为植物籽粒性状优；所述籽粒性状优可体现为e1和或e2和或e3：e1粒长粒宽大；e2粒长长；e3粒宽小。上述应用中，所述调控植物产量可为增加植物产量。为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括将编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加和或籽粒性状改变。上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒长粒宽增加。上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒长增加。上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒宽减少。上述方法中，编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子可为如下b1或b2或b3或b4所示的DNA分子：b1编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；b2核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b3与b1或b2限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子；b4在严格条件下与b1或b2限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由567个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述方法中，所述“将编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29。所述重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29具体可为向载体pCAMBIA3301的限制性内切酶BglⅡ和PmlI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。为解决上述技术问题，本发明还提供了植物育种方法。本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质ZmVps29的含量或活性，从而产量增加和或籽粒性状改变。上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒长粒宽增加。上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒长增加。上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒宽减少。上述任一所述粒长粒宽即粒长与粒宽的比值。上述任一所述粒长粒宽可为10粒长10粒宽。上述任一所述产量可为籽粒产量。所述籽粒产量可为单穗产量。上述任一所述植物可为如下c1至c10中的任一种：c1双子叶植物；c2单子叶植物；c3禾本科植物；c4十字花科植物；c5拟南芥；c6野生型拟南芥；c7玉米自交系黄早四；c8玉米自交系旅28；c9玉米自交系郑58；c10玉米品种Hi-Ⅱ。本发明还保护如序列表的序列3所示的分子标记甲或如序列表的序列4所示的分子标记乙。本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别玉米籽粒性状的方法，该方法可包括如下步骤：检测待测玉米的基因组DNA中基于ZmVps29基因的启动子的基因型为P1纯合型还是P2纯合型；P1纯合型玉米的籽粒性状优于P2纯合型；所述籽粒性状优体现为e1和或e2和或e3：e1粒长粒宽大；e2粒长长；e3粒宽小；P1纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且为纯合型；P2纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且为纯合型。本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别玉米产量的方法，该方法可包括如下步骤：检测待测玉米的基因组DNA中基于ZmVps29基因的启动子的基因型为P1纯合型还是P2纯合型；P1纯合型玉米的产量高于P2纯合型；P1纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且为纯合型；P2纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且为纯合型。上述方法中，所述产量可为籽粒产量。所述籽粒产量可为单穗产量。实验证明，在野生型拟南芥中过表达ZmVPS29基因，得到转ZmVps29基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转ZmVps29基因拟南芥的粒长增加和粒长粒宽增加。实验还证明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29在培育籽粒性状优良和或植物产量高的植物中具有重要的理论意义和实用价值。附图说明图1为实施例3步骤一的实验结果。图2为实施例3步骤二的实验结果。图3为实施例4的实验结果。图4为实施例5步骤二的实验结果。图5为实施例5步骤三的实验结果。图6为实施例5步骤四的实验结果。图7为实施例5步骤五的实验结果。图8为实施例6步骤二的实验结果。图9为实施例6步骤三中1的实验结果。图10为实施例6步骤四的实验结果。图11为实施例6步骤四的实验结果。图12为实施例6步骤五中1的实验结果。图13为实施例6步骤五中1的实验结果。图14为实施例6步骤五中2的实验结果。图15为实施例6步骤五中2的实验结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58、玉米品种Hi-Ⅱ和玉米自交系B73均来源于国家种质资源库网址为：http:www.cgris.net。公众可从中国农业科学院作物科学研究所即申请人处获得，以重复本实验。在下文中，玉米自交系黄早四简称黄早四或HZS或HZ4，玉米自交系旅28简称旅28或LV28，玉米自交系郑58简称郑58或Z58，玉米品种Hi-Ⅱ简称Hi-Ⅱ，玉米自交系B73简称B73。TRIzol试剂和M-MLV均为Invitrogen公司的产品。pLB零背景快速克隆试剂盒为天根生化科技北京有限公司的产品，产品目录号为VT205-01。克隆载体pLBVector为pLB零背景快速克隆试剂盒中的组件。SYBRPremixExTaqTM试剂盒为北京六合通经贸有限公司的产品，产品目录号为RR420A。2×SYBRPremixExTaq和50×ROXReferenceDyeII均为SYBRPremixExTaqII试剂盒中的组件。载体pGreen-GFP和载体pCAMBIA3301均记载于如下文献中：LuM，YingS，ZhangDF，etal.Amaizestress-responsiveNACtranscriptionfactor，ZmSNAC1，confersenhancedtolerancetodehydrationintransgenicArabidopsis[J].PlantCellReports，2012，319:1701-1711.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所即申请人处获得，以重复本实验。酶解液：先将Cellase0.3g、离析酶0.08g、甘露醇1.456g、KCl0.03g和MES0.078g溶于20mL超纯水，调节pH值至5.7；然后55℃水浴10min；最后冷却至室温后，加入CaCl20.0294g、BSA0.02g和β-巯基乙醇5μL。W5溶液：将NaCl9.0g、CaCl213.875g、2.5mL浓度为2MKCl水溶液和4mLpH5.7、0.5MMES缓冲液溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至1L。MMg溶液：将1.5mL浓度为1M的MgCl2水溶液、0.8mLpH5.7、0.5MMES缓冲液和7.3g甘露醇溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至100mL。40％PEG溶液：将PEG400040g、甘露醇3.64g、10mL浓度为1M的CaCl2水溶液溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至100mL。实施例1、ZmVps29基因的克隆黄早四和旅28具有不同的籽粒性状：黄早四粒长较短，粒宽较大，表现为圆形籽粒；旅28粒长较长，粒宽较小，表现为细长籽粒；黄早四的粒长粒宽远小于旅28的粒长粒宽，二者的籽粒性状存在显著差异。本申请的发明人根据前期玉米籽粒性状主效QTL的挖掘与图位克隆等实验结果，推测玉米基因组中ZmVps29基因与玉米籽粒性状相关。克隆ZmVps29基因的步骤如下：1、采用TRIzol试剂提取黄早四的幼嫩叶片组织的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到叶片组织的cDNA。2、以步骤1得到的叶片组织的cDNA为模板，以F1：5’-ACTCggATCATggTgTgCAg-3’和R1：5’-CgCATgAACAggTAgAAAgCg-3’为引物进行PCR扩增，得到约721bp的PCR扩增产物。3、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLBVector连接，得到重组质粒pLB-ZmVps29-HZS。对重组质粒pLB-ZmVps29-HZS进行测序。测序结果表明，重组质粒pLB-ZmVps29-HZS中含有序列表中序列1所示的DNA分子以下命名为ZmVps29基因，表达序列表中序列2所示的蛋白质以下命名为ZmVps29蛋白或蛋白质ZmVps29。按照上述方法，将步骤1中的黄早四的幼嫩叶片组织替换为旅28的幼嫩叶片组织，其它步骤均不变，得到重组质粒pLB-ZmVps29-LV28。对重组质粒pLB-ZmVps29-LV28进行测序。测序结果表明，重组质粒pLB-ZmVps29-LV28中也含有序列表中序列1所示的ZmVps29基因，表达序列表中序列2所示的蛋白质ZmVps29。上述结果表明，黄早四和旅28的基因组DNA中，均含有ZmVps29基因。实施例2、ZmVps29基因的启动子的克隆1、采用CTAB法提取处于三叶一心时期黄早四幼苗的叶片组织的基因组DNA，得到叶片组织的基因组DNA。2、以步骤1得到的叶片组织的基因组DNA为模板，以F2：5’-CTCACCCCCACAAGTCAAGA-3’和R2：5’-CCGACCGAACCAAACAAACA-3’为引物进行PCR扩增，得到约2351bp的PCR扩增产物。3、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLBVector连接，得到重组质粒丙。对重组质粒丙进行测序。结果表明，重组质粒丙中含有序列表中序列3所示的DNA分子。按照上述方法，将步骤1中处于三叶一心时期的黄早四幼苗的叶片组织替换为处于三叶一心时期旅28幼苗的叶片组织，其它步骤均不变，得到重组质粒丁。对重组质粒丁进行测序。结果表明，重组质粒丁中含有序列表中序列4所示的DNA分子。将序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子进行比对，结果表明，黄早四和旅28的基因组DNA中ZmVps29基因的启动子的核苷酸序列不同。推测ZmVps29基因的启动子的核苷酸序列不同造成蛋白质ZmVps29的表达量不同，进而形成不同的籽粒性状。实施例3、表达模式分析一、不同组织的表达模式1、采用TRIzol试剂提取黄早四材料黄早四处于三叶一心时期的根、黄早四处于三叶一心时期的茎、黄早四处于三叶一心时期的叶片、黄早四的雌穗、黄早四的雄穗、黄早四的穗位叶、黄早四的花丝或黄早四的籽粒的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到黄早四材料的cDNA。黄早四材料的cDNA中，DNA浓度为500ngμL。2、以步骤1得到的黄早四材料的cDNA为模板，采用RT-PCR检测ZmVps29基因的表达量以GAPDH基因作为内参基因。检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。实验结果见图1M为DNAmarker，1为黄早四处于三叶一心时期的根，2为黄早四处于三叶一心时期的茎，3为黄早四处于三叶一心时期的叶片，4为黄早四的雌穗，5为黄早四的雄穗，6为黄早四的穗位叶，7为黄早四的花丝，8为黄早四的籽粒。结果表明，黄早四的基因组DNA中ZmVps29基因为组成型表达基因，在上述黄早四各个组织中均表达。按照上述方法，将黄早四替换为旅28，其它步骤均不变。结果表明，旅28的基因组DNA中ZmVps29基因为组成型表达基因，在旅28各个组织中均表达。二、不同时期的玉米籽粒组织的表达模式1、采用TRIzol试剂提取籽粒黄早四自交授粉第6天的籽粒、黄早四自交授粉第12天的籽粒、黄早四自交授粉第18天的籽粒、黄早四自交授粉第24天的籽粒、旅28自交授粉第6天的籽粒、旅28自交授粉第12天的籽粒、旅28自交授粉第18天的籽粒或旅28自交授粉第24天的籽粒的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到籽粒的cDNA。籽粒的cDNA中，DNA浓度为500ngμL。2、以步骤1得到的籽粒的cDNA为模板，使用SYBRPremixExTaqTM试剂盒检测ZmVps29基因的相对表达量以GAPDH基因作为内参基因。检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。反应体系为20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL黄早四籽粒的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法LivakandSchmittgen，2001分析籽粒的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量。以黄早四自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它籽粒的ZmVps29基因的相对表达量见图2注：NS表示差异不显著，**表示差异极显著。结果表明，旅28自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第6天的籽粒，旅28自交授粉第12天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第12天的籽粒，旅28自交授粉第18天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第18天的籽粒。可见，与黄早四相比，旅28表达的蛋白质ZmVps29较多。因此，蛋白质ZmVps29的表达量越高，则粒长越长，粒宽越小，粒长粒宽越大。实施例4、亚细胞定位分析一、重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP的构建1、以实施例1步骤3得到的重组质粒pLB-ZmVps29-HZS为模板，以F3：5’-TTTTCTAGACATGGTGCTTGTGCT-3’下划线为限制性内切酶XbaI的识别位点和R3：5’-TTTGATATCGCCGTGCATCGTC-3’下划线为限制性内切酶EcoRⅤ的识别位点为引物进行PCR扩增，得到约590bp的PCR扩增产物。2、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLBVector连接，得到重组质粒pLB-ZmVps29。3、用限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ双酶切重组质粒pLB-ZmVps29，回收约590bp的片段甲。4、用限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ双酶切载体pGreen-GFP，回收约5300bp的载体骨架甲。6、将片段甲和载体骨架甲连接，得到重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP。根据测序结果，对重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP进行结构描述如下：向载体pGreen-GFP的限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1位至第564位所示的DNA分子。二、亚细胞定位分析1、制备玉米原生质体1取B73的种子，置于培养箱，25℃黑暗培养7-10天，得到玉米幼苗。2先切下步骤1得到的玉米幼苗第二片叶子的中间部分，然后切割成0.5mm×0.5mm小块，将这些小块命名为玉米组织。3将步骤2得到的玉米组织置于锥形瓶，加入20mL酶解液；然后用锡箔纸包裹锥形瓶，抽真空30min15个大气压；最后置于摇床上，先25℃、40rpm振荡培养3-4h，再25℃、80rpm振荡培养5min，得到消化液。4取步骤3得到的消化液，用尼龙网过滤，得到滤液。5取步骤4得到的滤液，1000rpm离心2min离心机设置为缓慢升降速模式，弃上清，将沉淀用W5溶液洗涤1-2次，即为制备的玉米原生质体。2、转化1取步骤1中5制备的玉米原生质体，加入适量的W5溶液，然后置于冰上放置30min；离心弃上清，向沉淀中加入适量MMg溶液进行重悬，得到原生质体浓度为5×105个mL的原生质体溶液。2将190μL原生质体溶液、10μL的重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP约15-20μg重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP和200μL浓度为40％PEG溶液轻轻混匀，25℃静置18min；然后加入1.6mLW5溶液，轻轻混匀，1000rpm离心1min，弃上清，将沉淀用W5溶液洗涤1-2次。3完成步骤2后，取所述原生质体，加入1.6mLW5溶液，置于细胞培养板中暗培养12-24h；然后置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察按照上述方法，将重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP替换为载体pGreen-GFP，其它步骤均不变，在共聚焦显微镜下观察，作为对照。实验结果见图3A为载体pGreen-GFP，其中左上为红光下视野，左下为红光和绿光叠加下视野，右上为绿光下视野，右下为白光下视野；B为重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP，其中左上为红光下视野，左下为红光和绿光叠加下视野，右上为绿光下视野，右下为白光下视野：载体pGreen-GFP转化玉米原生质体后，在细胞核、细胞质和细胞膜上均可观察到绿色荧光；重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP转化玉米原生质体后，仅在细胞膜上观察到绿色荧光。因此，蛋白质ZmVps29定位在细胞膜。实施例5、转基因拟南芥的获得及鉴定一、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29、GV3101pCAMBIA3301-ZmVps29和GV3101pCAMBIA3301的获得1、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29的获得1以实施例1步骤3得到的重组质粒pLB-ZmVps29-HZS为模板，以F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’下划线为限制性内切酶BglⅡ的识别位点和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’下划线为限制性内切酶PmlI的识别位点为引物进行PCR扩增，得到约590bp的PCR扩增产物。2按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤1得到的PCR扩增产物和克隆载体pLBVector连接，得到中间质粒。3用限制性内切酶BglⅡ和PmlI双酶切中间质粒，回收约590bp的片段乙。4用限制性内切酶BglⅡ和PmlI双酶切载体pCAMBIA3301，回收约9000bp的载体骨架乙。5将片段乙和载体骨架乙连接，得到重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29进行结构描述如下：向载体pCAMBIA3301的限制性内切酶BglⅡ和PmlI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。2、GV3101pCAMBIA3301-ZmVps29的获得将重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101pCAMBIA3301-ZmVps29。3、GV3101pCAMBIA3301的获得将载体pCAMBIA3301导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101pCAMBIA3301。二、转基因拟南芥的获得哥伦比亚生态型拟南芥为ArabidopsisBiologicalResourceCenter的产品，详见网址http:abrc.osu.edu。在下文中，哥伦比亚生态型拟南芥简称为野生型拟南芥或WT。1、采用拟南芥花序浸花转化法Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.199816，735-743.，将步骤一中2制备的GV3101pCAMBIA3301-ZmVps29转至野生型拟南芥中，获得T1代转ZmVps29基因拟南芥的种子。2、将T1代转ZmVps29基因拟南芥的种子种植于营养土中，25℃培养4周，然后喷施Basta筛选，能够正常生长的拟南芥抗性苗即为T1代转ZmVps29基因阳性苗。T1代转ZmVps29基因阳性苗收到的种子即为T2代转ZmVps29基因拟南芥的种子。3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转ZmVps29基因拟南芥的种子播种于含7mgL草铵膦phosphinothricin，PPT的MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥抗性苗的数目与不能够正常生长的拟南芥非抗性苗的数目比例为3：1，则该株系为ZmVps29基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转ZmVps29基因拟南芥的种子。4、将步骤3筛选出的T3代转ZmVps29基因拟南芥的种子再次播种于含7mgLPPT的MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转ZmVps29基因拟南芥。将其中13个T3代纯合转ZmVps29基因拟南芥的株系依次命名为OE12-1至OE12-13，并进行后续实验。T1代转ZmVps29基因拟南芥的Basta筛选具体见图4A和B均为喷施Basta前，C为喷施Basta后。按照上述方法，将GV3101pCAMBIA3301-ZmVps29替换为GV3101pCAMBIA3301，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。三、分子鉴定1、分别取OE12-1至OE12-13的T3代种子，种植于营养土中，25℃培养4周，得到OE12-1至OE12-13的幼苗。2、分别提取OE12-1至OE12-13的幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’组成的引物对1进行PCR扩增，然后进行电泳。3、分别提取OE12-1至OE12-13幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F6：5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’和R6：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’组成的引物对2进行PCR扩增，然后进行电泳。按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照。按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29，其它步骤均相同，作为阳性对照。部分实验结果见图5A为采用引物对1的PCR扩增结果，B为采用引物对2的PCR扩增结果；其中M为DNAMarker，泳道1-10为OE12-1至OE12-10。结果表明，以OE12-1至OE12-13的幼苗的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29为模板，采用引物对1均能扩增得到587bp的条带，采用引物对2均能扩增得到444bp的条带；以水或转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA为模板，采用引物对1均不能扩增得到587bp的条带，采用引物对2均不能扩增得到444bp的条带。经过分子鉴定，OE12-1至OE12-13均为转ZmVps29基因拟南芥。四、检测转ZmVps29基因拟南芥的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量1、采用TRIzol试剂提取拟南芥幼苗野生型拟南芥幼苗、转空载体拟南芥幼苗、OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗或OE12-13的幼苗的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到拟南芥幼苗的cDNA。拟南芥幼苗的cDNA中，DNA浓度为500ngμL。2、以步骤1得到的拟南芥幼苗的cDNA为模板，使用SYBRPremixExTaqTM试剂盒检测拟南芥幼苗的ZmVps29基因的相对表达量以Actin基因作为内参基因。检测ZmVps29基因的引物为F4：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和R4：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测Actin基因的引物为正向引物6：5’-AGGTATCGCTGACCGTATGAG-3’和反向引物6：5’-GCTGAGGGAAGCAAGAATG-3’。反应体系为20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL拟南芥幼苗的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法LivakandSchmittgen，2001分析拟南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量。各个拟南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量见图6WT为野生型拟南芥幼苗。结果表明，OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗和OE12-13的幼苗的cDNA中ZmVps29基因均有一定程度的表达，野生型拟南芥幼苗和转空载体拟南芥幼苗的cDNA中均没有ZmVps29基因的表达。五、转ZmVps29基因拟南芥的籽粒性状的鉴定实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：分别将野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、OE12-1的T3代种子、OE12-2的T3代种子、OE12-3的T3代种子、OE12-4的T3代种子、OE12-6的T3代种子、OE12-7的T3代种子、OE12-8的T3代种子、OE12-9的T3代种子、OE12-11的T3代种子和OE12-13的T3代种子种植于营养土中，25℃培养至成熟，收获种子。将收获的种子置于40倍体视镜下拍照，利用ImageJ软件测量种子的粒长和粒宽，并计算粒长粒宽。部分实验结果见图7WT为野生型拟南芥和表2：转ZmVps29基因拟南芥的种子为细长籽粒，均表现为粒长增加、粒长粒宽增加，大部分籽粒的粒宽增加；野生型拟南芥种子和转空载体拟南芥种子的粒长、粒宽和粒长粒宽无显著差异；与野生型拟南芥种子相比，OE12-8的T3代种子、OE12-6的T3代种子、OE12-9的T3代种子和OE12-11的T3代种子的粒长和粒宽均有显著差异、粒长粒宽无显著差异，E12-1的T3代种子、OE12-2的T3代种子和OE12-7的T3代种子的粒长、粒宽和粒长粒宽均有显著差异，OE12-3的T3代种子、OE12-4的T3代种子和OE12-13的T3代种子的粒长和粒长粒宽均有显著差异。表2拟南芥粒长粒宽P值粒长P值粒宽P值WT1.732无93.885无54.412无OE12-81.733NS108.940**63.071**OE12-61.746NS107.880**61.925**OE12-91.778NS111.630**63.078**OE12-111.783NS101.470**57.178**OE12-21.784*104.110**58.596**OE12-11.798*105.020**58.639**OE12-71.804**105.490**58.691**OE12-41.843**101.960**55.560NSOE12-131.875**103.940**55.729NSOE12-31.913**101.680**53.434NS注：NS表示P＞0.05，即差异不显著；*表示0.01＜P≤0.05，即差异显著；**表示P≤0.01，差异极显著。上述结果表明，蛋白质ZmVps29可调控拟南芥籽粒的性状。实施例6、转基因玉米的获得及鉴定一、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29和EHA105pCAMBIA3301-ZmVps29的获得1、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29的获得同实施例4步骤一中1。2、EHA105pCAMBIA3301-ZmVps29的获得将重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105pCAMBIA3301-ZmVps29。二、T0代转ZmVps29基因玉米的获得采用农杆菌侵染玉米幼胚的转化方法，将步骤一中2制备的EHA105pCAMBIA3301-ZmVps29转至Hi-Ⅱ中，获得T0代拟转ZmVps29基因玉米。在T0代拟转ZmVps29基因玉米的叶片上涂抹Basta，叶片能够正常生长的植株抗性苗即为T0代转ZmVps29基因玉米。T0代拟转ZmVps29基因玉米的Basta筛选具体见图8左图为玉米叶片能够正常生长，右图为玉米叶片不能够正常生长。将得到三个T0代转ZmVps29基因玉米分别命名为ZmVPS12-1、ZmVPS12-2和ZmVPS12-3。三、T1代转ZmVps29基因玉米的获得1、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的获得1采集ZmVPS12-1的花粉，与黄早四进行杂交，得到T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。2分别提取T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的叶片的基因组DNA并以其作为模板，以F7：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’和R7：5’-TCGCCGTCAATCAGCTCGTA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果能够获得584bp的PCR扩增产物，则相应的T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1；如果不能获得584bp的PCR扩增产物，则相应的T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。部分实验结果见图9M为DNAMarker，泳道1-75为75个T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。采用上述方法可以得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。2、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的获得按照步骤1的方法，将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-2的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2。3、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的获得按照步骤1的方法，将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-3的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3。4、T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ的获得采集Hi-Ⅱ的花粉，与黄早四进行杂交，得到T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ。5、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的获得按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1。6、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的获得按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”且将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-2的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2。7、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的获得按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”且将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-3的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3。8、T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ的获得采集Hi-Ⅱ的花粉，与郑58进行杂交，得到T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ。四、检测T1代转ZmVps29基因玉米中的ZmVps29基因的相对表达量1、玉米材料的获得1随机取5株T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1，进行如下操作：分别取旗叶，混合，得到黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料；分别取自交授粉第6天的籽粒，混合，得到黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料。2按照步骤1的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2，其它步骤均不变，得到黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料和黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料。3按照步骤1的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3，其它步骤均不变，得到黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料和黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料。4按照步骤1的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ，其它步骤均不变，得到黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料和黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料。2、采用TRIzol试剂提取玉米材料黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料、黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料、黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料、黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料或黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到玉米材料的cDNA。玉米材料的cDNA中，DNA浓度为500ngμL。3、以步骤2得到的玉米材料的cDNA为模板，使用SYBRPremixExTaqTM试剂盒检测玉米材料的ZmVps29基因的相对表达量以GAPDH基因作为内参基因。检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。反应体系为20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL拟南芥幼苗的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法LivakandSchmittgen，2001分析玉米材料的ZmVps29基因的相对表达量。以黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它叶片材料的相对表达量见图10WT为黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料，ZmVPS12-1为黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料，ZmVPS12-2为黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料，ZmVPS12-3为黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料。以黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它籽粒材料的相对表达量见图11WT为黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料，ZmVPS12-1为黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料，ZmVPS12-2为黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料，ZmVPS12-3为黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料。结果表明，T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2或T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的叶片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量均显著高于T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ。按照上述方法，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1”，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2”，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3”，将“T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ”替换为“T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ”，其它步骤均不变，得到各个玉米材料的相对表达量。结果表明，T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2或T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的叶片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量均显著高于T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ。五、籽粒性状的鉴定1、测量待测果穗上种子的10粒长cm和10粒宽cm。待测果穗为步骤三中1得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中1得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中2得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中2得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中3得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中3得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中5得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中5得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中6得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中6得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中7得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗或步骤三中7得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗。部分实验结果图12和图13。2、测量待测果穗上种子的10粒长cm、10粒宽cm、10粒长10粒宽和单穗产量g。待测果穗为步骤三中1得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中2得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中3得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中4得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ的果穗、步骤三中5得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中6得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中7得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗或步骤三中8得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ的果穗。实验结果见图14左上为10粒长，右上为10粒宽，左下为10粒长10粒宽，右下为单穗产量；WT为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3和图15左上为10粒长，右上为10粒宽，左下为10粒长10粒宽，右下为单穗产量；WT为T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3。上述结果表明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29可调控玉米籽粒的性状和单穗产量。中国农业科学院作物科学研究所蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用4PatentInversion3.51567DNA玉米ZeamaysL.1atggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgcacatcccgcaccgggcgcccgacctcccc60gccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaagatccaacacatcatctgcactggcaat120ctctgcatcaaggaagtccatgactacctgaaaagcctttgccctgatctccatattacc180agaggtgaacatgatgaggatgctcgatacccagagactaagacacttacaattggtcag240tttaagcttgggctgtgccatggccatcaggttgttccatggggcgacctggactccctg300gcgatgctccagcggcagctggacgtggacatcctggtgaccgggcacacgcaccagttc360aaggcatataagcacgagggaggcgtggtgatcaaccctggctctgccacgggcgcctac420agcagcatcacttacgacgtgaacccaagctttgtgctgatggacatcgacgggctccgt480gtggtggtgtacgtctacgagctgattgacggcgaggtgaaggtggacaaaatcgacttc540aagaagactgcgacgatgcacggctag5672188PRT玉米ZeamaysL.2MetValLeuValLeuAlaLeuGlyAspLeuHisIleProHisArgAla151015ProAspLeuProAlaLysPheLysSerMetLeuValProGlyLysIle202530GlnHisIleIleCysThrGlyAsnLeuCysIleLysGluValHisAsp354045TyrLeuLysSerLeuCysProAspLeuHisIleThrArgGlyGluHis505560AspGluAspAlaArgTyrProGluThrLysThrLeuThrIleGlyGln65707580PheLysLeuGlyLeuCysHisGlyHisGlnValValProTrpGlyAsp859095LeuAspSerLeuAlaMetLeuGlnArgGlnLeuAspValAspIleLeu100105110ValThrGlyHisThrHisGlnPheLysAlaTyrLysHisGluGlyGly115120125ValValIleAsnProGlySerAlaThrGlyAlaTyrSerSerIleThr130135140TyrAspValAsnProSerPheValLeuMetAspIleAspGlyLeuArg145150155160ValValValTyrValTyrGluLeuIleAspGlyGluValLysValAsp165170175LysIleAspPheLysLysThrAlaThrMetHisGly18018532351DNA人工序列3ctcacccccacaagtcaagaacaggtaccacaggatgaggcgcatggaggatgctgcgat60gtgttcgtgagaggtctaggccgtcgtctcctagtcaactttgggttgctggatcgttgt120ctccttaccatgtaattatttatttattttgtacagaactcctattatatagtaaagtta180ttacattcatttctgtaccatgatttatcatatgtgtgagacttggtcccagcacacctg240gtgattatgttcgcgcctgggtccctaaaactcgagtgtgacagagggcgtgcggagatg300gccggaaaacgcgtgaacgtggacgcatccacgatgggggcgtgggtgggaggttaggga360cgaggtctgacgggtgggtccgcaggacagagagagaggatgagcgcgtgcgaggggatc420agcaccgacaggccgaccccacagagcacagagagagagagaaggggtgcgtgggctggc480gccgataggccgggtccgtctgtccgacttgggctgaaatggttttttctatttttcagg540gaatttctagtgtttttctatttatgttctctagggttttgaattcaaattcaaactaaa600tcaaacatgtgcaacaatttaaaaaatatttggagctcagcacgatgcaacatttcatga660ctcatattattttgacaaaataaaataatcaacccctcactaattaagctaattctacta720aaaagaaaaagagagagaaactagagagagaggagtaacacctgaatttggtaggtaatt780agaaagaaattttatacccccaaatttagggtgttacaacctctgcggacaaggcaaaat840gcgcagttatttgaaaggaatattcgaaccaaggttcgatctaccacggccacggcccgc900cggcggcggcggcacgcgcgtgtgtggtcgtctttcattcttttcccaacttcttaatag960atgcaccaattggtgcacctatttaagttgattgattgatctcttaaacttacaatatgg1020tactaaattattagtacaccatatcattaaagtggaccactagcattgactattattgaa1080tattaattgggccaagccaacattaatccaatataaacaatgataattaggtaatatttt1140gaataatatggatgacataaatcttgaaaatataggatacatggagattatgtattgaac1200ttgagaaatctatagacagagtttctgaattgaactaggtaaatctgtaaacgggaatac1260tgaattatactccctctctttagaaaattaacaaattcttacaatacttgatgtatgtat1320tatatatatgtgtatagatttattatcattcatttgaatatagacataaaaccaagatct1380aaaacgaatactattttagacggagagagtatagatttgtaagaatctatttagctgatg1440tatcctttcagttaggattcaatttttttttaataggaggattcaaattttttgatagta1500catctagattctagaccgtcgatctttcaaacgttgaaaagaggaagaagagcttgacgt1560tttgcttagcttaacgctagcccaacgaacttggcgaaaccgatggagcctcaaacgggc1620cgtatccgtcgtgcacagcatgctaaagcccagtgctgacgacgacgaacaacactcatc1680cggcccggtcatgagcccaatgcggggccacttcgtcgtttttgacaagtagacccacag1740tggccccacgtgcttgcccctccctttctcttctccccttgtgtcgcgctcgcgcatctg1800aagcaagggggggaagggccaagggggatcggtcttgttctcggagagggttgagctgct1860tgacggttttgactcggatcatggtgtgcagctctatcagatagagagctgacgtgaggt1920gtgagacgcggatcgtggagtactactcagtaggagaggtggggagggggaagaaggcga1980tagccggggaggatggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgcacatcccgcaccgggcg2040cccgacctccccgccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaagatccaacacatcatc2100tgcactggcaatctctgcatcaaggtaaccttaccttccgcgcctggccggccggccggg2160taaccggcgtccctcggcgatcgattttacaatcctttcctctcgcctcatgtgtccaat2220ttttgcgctggctaggtcgtactgccgcggatagttgcatcacgtgagaaatcgttatgg2280ttcttaggtcgtgctgggatcagccgcatcgctgtattagtctactgcagttgtttgttt2340ggttcggtcgg235142367DNA人工序列4ctcacccccacaagtcaagaacaggtaccacaggatgaggcgcatggaggatgctgcgat60gtgttcgtgagaggtctaggccgtcgtctcctagtcaactttgggttgatggatcgttgt120ctccttaccatgtatttatttatttattttgtacagaactcctattatatagtaaagtta180ttacattcgtttctgtaccatgatttatcatatgtgtgagacttggtcccagcgcacctg240gtgattatgttcgcgcccgggtccctaaaacccgagtgtgacagagggcgtgcggagatg300gccggaaaacgcgtgaacgtggacgcatccacgatgggggcgtgggtgggaggttaggga360cgaggtctgacgggtgggtccgcagggcagagagagaggatgagcgcgtgcgaggggatc420agcaccgacaggccgaccccacagagcagagagagagagagagaaggggtgcgtgggctg480gcgccgataggccgggtccgtctgtccgacttgggctgaaatggttttttctatttttca540gggaatttctaatgtttttctatttatgttctctagggttttgaattcaaattcaaacta600aatcaaacatgtgcaacaatttaaaaaatatttggagctcaccacgatgcaacatttcat660gactcatattgttttgacaaaataaaataatcaacccctcactaattaagctaattctac720taaaaagaaaaagagagagaaactagagagagaggagtaacacctgaatttggtaggtaa780ttagaaagaaattttatacccccaaatttagggtgttacaacctctgcggacaaggcaaa840atgcgcagttatttgaaaggaatattcgaaccaaggttcgatctaccacggccacggccc900gccggcggcggcggcacgcgcgcgtgtggtcgtttttcattcttttcccaacttcttaat960agatgcaccaattggtgcacctatttaagttgattgattgatctcttgaacttacaatat1020gatactaaattattagtataccatatcattaaagtggaccactagcattgactattattg1080aatattaattgggccaagccaacattaatccaatataaacaatgataattaggtaatatt1140ttgaataatatggatggcataaatcttgaaaatataggatacatggagattatgtattga1200acttgagaaatctatagacagagtttctgaattgaactaggtaaatctgtaaacgggaat1260actgaattatactccctctctttagaaaattaacaaattcttacaatacttgatgtatgt1320attatatatatgtgtatagatttattatcattcatttgaatatagacataaaaaccaaga1380tctaaaacgaatactattttagacggagagagtatagatttgtaagaatctatttagctg1440atgtatcctttcagttaggattcaatttttttttaataggaggattcaaattttttgata1500gtacatctagattctagaccgtcgatctttcaaacgttgaaaagaggaagaagagcttga1560cgttttgcttagcttaacgctagcccaacgaacttggcgaaaccgatggagcctcaaacg1620ggccgtatccgtcgtgcacagcatgctaaagcccagtgctgacgacgacgaacaacactc1680atccggcccggtcatgagcccaatgcggggccacttcgtcgtttttgacaagtagaccca1740cagtggccccacgtgcttgcccctccctttctcttctccccttgtgtcgcgctcgcgcat1800ctgaagcaagggggggaagggccaagggggatcggtcttgttctcggagagggttgagct1860gcttgacggttttgactcggatcatggtgtgcagctctatcagatagagagctgacgtga1920ggtgtgagacgcggatcgtggagtactactcagtaggagatcaagaggaaggaggtgggg1980agggggaagaaggcgatagccggggaggatggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgca2040catcccgcaccgggcgcccgacctccccgccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaa2100gatccaacacatcatctgcactggcaatctctgcatcaaggtaaccttaccttccgcgcc2160tggccggccggccgggtaaccggcgtccctcggcgatcgattttacaatcctttcctctc2220gcctcatgtgtccaatttttgcgctggctaggtcgtactgccgcggatagttgcatcacg2280tgagaaatcgttatggttcttaggtcgtgctgggatcagccgcatcgctgtattagtcta2340ctgcagttgtttgtttggttcggtcgg2367

权利要求：1.蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状为d1）和或d2）和或d3）：d1）粒长粒宽；d2）粒长；d3）粒宽；所述蛋白质ZmVps29为a1）或a2）：a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。2.编码权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的核酸分子在调控植物籽粒性状和或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状为d1）和或d2）和或d3）：d1）粒长粒宽；d2）粒长；d3）粒宽；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物籽粒性状为植物籽粒性状优；所述籽粒性状优体现为e1）和或e2）和或e3）：e1）粒长粒宽大；e2）粒长长；e3）粒宽小；所述调控植物产量为增加植物产量。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物；所述单子叶植物为禾本科植物。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述单子叶植物为玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58或玉米品种Hi-Ⅱ。6.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加和或籽粒性状改变；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。7.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的含量或活性，从而产量增加，和或，粒长粒宽增加；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物；所述单子叶植物为禾本科植物。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述单子叶植物为玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58或玉米品种Hi-Ⅱ。

百度查询： 中国农业科学院作物科学研究所 蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用