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申请/专利权人：上海海洋大学

摘要：本发明公开了嗜水气单胞菌噬菌体AH10‑Phage‑QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途，属于水产养殖细菌疾病防治技术领域。噬菌体AH10‑Phage‑QY01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019109，还包括噬菌体AH10‑Phage‑QY01在制备由嗜水气单胞菌导致的细菌性败血症疾病的用途，可以单独使用或其与抗生素联用。本发明利用噬菌体存在的普遍性和对宿主菌的高特异性，针对致病菌从自然环境中首次筛选出嗜水气单胞菌噬菌体AH10‑Phage‑QY01，用于抑制、裂解致病菌，治疗或防控由该致病菌所导致的细菌性败血症等细菌性鱼病。

主权项：1.嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019109。

全文数据：噬菌体AH10-Phage-QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途技术领域本发明属于水产养殖细菌疾病防治技术领域，具体涉及嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01及其在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途。背景技术细菌性鱼病是淡水水产养殖业的主要病害，流行期间不仅导致养殖品种和鱼卵大面积死亡，也使养殖产品失去商品价值，造成严重的经济损失。细菌性鱼病易得难治且易产生耐药性，目前由于抗生素药物的大量使用各种水产致病菌的耐药性越来越强，细菌性鱼病的防控难度也越来越大。嗜水气单胞菌AeromonasHydrophila感染造成的败血症是鲤、鲫鱼的一种高致病性细菌病，其病原为嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila,AH，细菌性败血症频发，给鲫鱼养殖业造成了破坏性影响。气单胞菌属Aeromonas，其属于短杆菌，单鞭毛，运动极为活泼的兼性厌氧型革兰氏阴性菌，生长温度较广0～45度，营养要求不高，普通平板，微白色半透明的菌落，在血琼脂上形成灰白、光滑、湿润、凸起的菌落，多数有β溶血，肠道选择培养基上，大多数菌株形成乳糖不发酵菌落，TCBS琼脂上生长不良。嗜水气单胞菌感染鲫鱼可引起其内脏组织、鳃和体表广泛性出血，一般病势较猛，多为恶性传染病，死亡率极高。已有嗜水气单胞菌的常规抗菌药物如甲砜霉素、庆大霉素、土霉素、新诺明等，其主要成分多为抗生素或磺胺类药物。由于长期以来人们对抗生素的大量使用，细菌对抗生素的耐药性逐年增强，抗生素的抑菌效果逐年下降，为达到治疗效果所需使用的抗生素剂量越来越大，长期下去，对于嗜水气单胞菌等强耐药菌将面临无药可用的局面。噬菌体Phage是侵袭细菌的病毒，它必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方，如泥土、动物的肠道里，都可以找到噬菌体。利用噬菌体存在的普遍性和对宿主菌的高特异性，可以针对嗜水气单胞菌这种致病菌筛选出其对应的噬菌体并用于抑制、杀灭该致病菌。使用噬菌体或噬菌体与抗生素联用的方法来代替单纯的抗生素疗法可以有效减少细菌对抗生素的耐药性。同时，因为噬菌体在环境中普遍存在，使用噬菌体疗法并不会对环境造成太大影响，绿色、安全、可靠。发明内容本发明利用噬菌体存在的普遍性即安全性，本身广泛存在于自然界中，不会对环境产生不利影响和对宿主菌的高特异性，针对致病菌从自然环境中首次筛选出嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01，可用于抑制、裂解致病菌，治疗或防控由该致病菌所导致的细菌性败血症等细菌性鱼病。针对目前细菌性鱼病特别是高致病性细菌病嗜水气单胞菌AeromonasHydrophila感染造成的败血症易得难治、耐药性强以及防控难度大的问题，本发明的目的在于提供嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途。本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01AeromonashydrophilabacteriophagesAH10-Phage-QY01，已于2019年2月25日保藏在位于湖北省武汉市武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019109。所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途。进一步，所述药物以所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01为活性成分，还包括药学上可接受的载体；所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01的使用剂量不低于1×107pfumL。进一步地，将噬菌体或其裂解液投入在养殖水体中，使养殖水体中的噬菌体数量最低达到1×107pfumL～9×107pfumL时一般制备的噬菌体原液滴度约为1012pfumL，即使用剂量将原液按1：100000稀释，对水体中的嗜水气单胞菌可以起到较好的控制作用。进一步，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01在制备由嗜水气单胞菌导致的细菌性败血症疾病药物的用途。进一步，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01单独使用，或其与抗生素联用。进一步，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01单独使用的剂量不低于1×107pfumL；所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01与抗生素联用的剂量比为1：1，且所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01的使用剂量不低于1×107pfumL。AH10-phage-QY01可作为抗生素辅助治疗剂，与抗生素联用对具有耐药性的致病菌起到防控作用，其与抗生素联用的使用剂量和其单独使用剂量一致，其与抗生素联用的剂量比为1：1。本发明的有益效果是：1.相较于水产致病菌传统的药物疗法，本发明利用噬菌体存在的普遍性和对宿主菌的高特异性，针对致病菌从自然环境中首次筛选出嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01，用于抑制、裂解致病菌，治疗或防控由该致病菌所导致的细菌性败血症等细菌性鱼病。2.本发明筛选的嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01对嗜水气单胞菌抑菌效果非常强，且持续时间很长，使用该噬菌体替代抗生素或与抗生素联用可对耐药性强的嗜水气单胞菌良好的抑菌效果，用于防治水产养殖嗜水气单胞菌病，减少抗生素的使用量。3.本发明筛选的嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01具有很高的特异性，仅对嗜水气单胞菌具有良好的抑制效果而不影响其他菌落的生长，绿色、安全、高效。附图说明图1为嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01对嗜水气单胞菌的抑菌效果；其中，感染复数为0.1，37度培养8h。图2为嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01对嗜水气单胞菌的抑菌效果持续时间；其中，感染复数均为0.1，且从左至右依次为：37度培养12h、37度培养24h、37度培养48h。保藏信息如下：嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01AeromonashydrophilabacteriophagesAH10-Phage-QY01，已于2019年2月25日保藏在位于湖北省武汉市武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019109。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。实施例：嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01的筛选、分离和提纯利用噬菌体存在的普遍性和对宿主菌的高特异性，以下实例中，针对各类水产养殖致病菌从自然环境中筛选出其对应的噬菌体并用于治疗该致病菌所导致的水产养殖细菌病。具体步骤为：取采样样品50ml，4000rpmmin离心30min。吸取10ml上清液，用0.22um滤器过滤除菌。将25ml3倍浓缩的LB液体培养基加入到200ml锥形瓶中，冷却至室温，将滤液加入到锥形瓶中，并加入宿主菌1ml，同时加入0.5M氯化钙至终浓度0.1mM，28度培养12～14h。取出培养液3ml加入5ml的无菌试管中，加入氯仿至终浓度为3％，震荡2min，室温静置2h。取1ml上清液0.22um滤器过滤除菌，将滤液10倍倍比稀释至10-5。取各梯度的稀释液100ul与200ul宿主菌混均，28度孵育15min后与5ml42度已融化的上层LB0.4％的琼脂混匀，浇注在底层LB平板上，室温静置15min后待上层琼脂凝固后，倒置于28度培养箱培养8h。观察培养8h的平板，挑取单斑于5mlLB液体中，加入200ul新鲜宿主菌，加入氯化钙至终浓度0.1mM，28度静置培养过夜。取出，4000rpmmin离心30min，0.22um滤膜过滤后滤液10倍倍比梯度稀释。重复6、7、8步骤3～5次，直至得到形状、大小、性质稳定噬菌斑。挑纯化好的噬菌斑放入含有1ml宿主菌的1.5ml离心管，37度培养6～12h。15000g离心10min，取上清用0.22um滤膜过滤后加入一个新的1.5ml离心管，加入200ulPEG8000溶液。颠倒混匀，放置15min。15000g离心20min得到噬菌体颗粒。用200ulTE缓冲液重悬，得到高滴度的噬菌体原液，可用于保种或DNA样品提取材料。效果例1：验证噬菌体的抑菌效果以嗜水气单胞菌为例，将实施例中纯化好并进行富集培养后获得的嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01原液滴度在10-10～10-12pufml以感染复数为0.120ul噬菌体原液和200ul嗜水气单胞菌混合的比例与嗜水气单胞菌混合，在37℃培养箱放置10分钟后倒双层平板，用封口膜封好平板置于37℃培养箱培养8h后可见明显噬菌斑，如图1所示。效果例2：验证噬菌体的抑菌效果持续时间如图2所示，嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01可以快速、有效地裂解嗜水气单胞菌并抑制其菌落生长，且出现噬菌斑的平板，噬菌斑随着时间的增加而增大，直至所有的噬菌斑连接到一起将平板上的菌苔全部蚕食完。

权利要求：1.嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019109。2.权利要求1所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物以所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01为活性成分，还包括药学上可接受的载体。4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01的使用剂量不低于1×107pfumL。5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01在制备由嗜水气单胞菌导致的细菌性败血症疾病药物的用途。6.根据权利要求2或5所述的用途，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01单独使用，或其与抗生素联用。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01单独使用的剂量不低于1×107pfumL；所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01与抗生素联用的剂量比为1：1，且所述嗜水气单胞菌噬菌体AH10-Phage-QY01的使用剂量不低于1×107pfumL。

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