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申请/专利权人：中国医科大学附属盛京医院

摘要：本发明提供了Hsp90抑制剂17‑DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用，属医药生物技术领域。通过实验验证了Hsp90抑制剂17‑DMAG与阿糖胞苷联用能协同促进白血病细胞的凋亡，但其与柔红霉素和依托泊苷联用无法获得类似效果。为确立17‑DMAG联合阿糖胞苷的化疗方案在儿童ALL化疗中的合理应用提供了依据，为提高白血病患者化疗效果，改善耐药提供了可能性；且首次提出在儿童ALL中，17‑DMAG和阿糖胞苷作为活性成分在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

主权项：1.一种Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用，其特征在于，所述抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物以Hsp90抑制剂17-DMAG和阿糖胞苷作为活性成分。

全文数据：Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用技术领域本发明属医药生物技术领域，具体涉及Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用。背景技术儿童白血病占儿童恶性肿瘤首位，急性淋巴细胞白血病ALL占儿童白血病的90%，当前ALL的治疗以危度评估为基础的联合化疗为主要手段。但高危患儿本身极易发生化疗耐药，标中危患儿中也有部分于正规化疗后出现复发。儿童ALL化疗耐药复发后的治疗非常棘手，再次化疗的完全缓解率明显降低，骨髓移植效果亦不满意，患儿死亡率高。长期以来，化疗耐药复发一直是儿童ALL治疗的瓶颈性问题，严重影响长期生存率。针对儿童ALL化疗耐药复发的治疗没有突破性进展。热休克蛋白90（Heatshockprotein90，Hsp90）在儿童ALL高危组中过表达，有报道Hsp90在急性白血病中高度表达与病情的发展及预后密切相关。Hsp90抑制剂对癌细胞具有高度选择特异性。Hsp90抑制剂17-DMAG（17-[2-二甲基氨基乙基氨基]-17-去甲基格尔德霉素）作为小分子靶向药物，在成人晚期实体瘤、淋巴瘤、急性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病中已经进入临床I期试验。但17-DMAG在儿童ALL联合化疗中的应用价值，其与一线化疗药物之间的相互作用并不清楚，其具体作用机理也尚不明确。发明内容本发明的第一目的在于提供了一种Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用。本发明的第二目的在于提供一种Hsp90抑制剂17-DMAG在儿童ALL联合化疗中与一线化疗药物联用从而增加一线化疗药物杀伤的方法。针对现有技术不足，本发明提供了一种Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用，以Hsp90抑制剂17-DMAG和阿糖胞苷作为制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的活性成分。一种抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其特征在于，包括含有治疗量的Hsp90抑制剂17-DMAG和阿糖胞苷，以及药学上的载体或者赋形剂。所述Hsp90抑制剂17-DMAG为任何药物治疗学上可接受的剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂，优选剂型为注射制剂。所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。所述抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型，优选剂型为注射制剂。本发明提供了一种Hsp90抑制剂17-DMAG在儿童ALL联合化疗中与一线化疗药物联用从而增加一线化疗药物杀伤的方法，所述一线化疗药物为阿糖胞苷。所述Hsp90抑制剂17-DMAG不但能够单药杀伤白血病细胞，同时可以增加阿糖胞苷的化疗效果；具体表现为17-DMAG单药促进ALL细胞系（Nalm6及Reh）及来自ALL患者（27例）的原代白血病细胞凋亡，同时促进了阿糖胞苷诱导的细胞凋亡。所述Hsp90抑制剂17-DMAG与柔红霉素或依托泊苷联用时，不能促进柔红霉素和依托泊苷的细胞杀伤作用。本发明的有益效果在于。（1）本发明给予ALL细胞系（Nalm6及Reh）及来自ALL患者的原代白血病细胞17-DMAG药物处理后，不但单药可以诱导白血病细胞凋亡，与阿糖胞苷联用发生协同效应，大大提高了阿糖胞苷的化疗效果，但与柔红霉素和依托泊苷联合应用无法收到类似效果，为确立17-DMAG联合阿糖胞苷的化疗方案在儿童ALL化疗中的合理应用提供了依据，为提高白血病患者化疗效果，改善耐药提供了可能性。（2）本发明首次提出在儿童ALL中，17-DMAG和阿糖胞苷作为活性成分在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用。附图说明图1为17-DMAG（17-[2-二甲基氨基乙基氨基]-17-去甲基格尔德霉素）分子式图。图2为17-DMAG抑制ALL细胞系（Nalm6及Reh）增殖图。图3为17-DMAG诱导ALL细胞株Nalm6及Reh凋亡图，其中：图3-1为代表性细胞凋亡结果，图3-2为定量统计图。图4为17-DMAG诱导ALL原代细胞凋亡图，其中：图4-1为代表性原代细胞凋亡结果图，图4-2为定量统计图图5为17-DMAG促进阿糖胞苷的化疗效果图，其中：图5-1为代表性细胞凋亡结果，图5-2为定量统计图。图6为17-DMAG不能促进柔红霉素和依托泊苷的化疗效果图。具体实施方式下面结合附图对具体实施方式加以说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.不同浓度的17-DMAG处理白血病细胞株，检测对白血病细胞增殖的抑制效应。不同浓度的17-DMAG（商品化粉剂溶于DMSO，分子式见附图1）以0，0.01，0.1，1，10，100μM浓度处理白血病细胞株（Nalm6和Reh细胞）检测细胞存活情况。细胞活力检测方案为：取对数生长期的Nalm6和Reh细胞调整浓度为3×105mL接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μL，每孔加入17-DMAG50μL，每孔药物终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100μM，同时设置DMSO对照组与只加培养基的空白对照组。24h、48h、72h后加入20μLMTS，继续孵育4h，使用酶标仪测定490nm波长的吸光度值，取重复孔平均值，根据存活率=（实验组吸光度值-空白对照组吸光度值）（对照组吸光度值-空白对照组吸光度值）×100%计算细胞存活率。所有实验独立重复3次。结果显示白血病细胞增殖被抑制，抑制效应呈显著的剂量依赖关系，见附图2。实施例2.17-DMAG（1μM、10μM）处理白血病细胞株，检测诱导细胞凋亡效应。白血病细胞株Nalm6和Reh细胞重悬为3×105ml接种于6孔板中。17-DMAG（1μM、10μM）处理白血病细胞，同时设置DMSO对照组。48h后采用AnnexinV-FITCPI法检测白血病细胞凋亡。17-DMAG10μM处理27名初诊ALL患儿骨髓来源的白血病原代细胞48h后检测细胞凋亡情况。凋亡检测方案为：收集单细胞悬液，冷PBS洗涤两次，1×105细胞重悬于300μL1×bindingbuffer，加入AnnexinV-FITC5μL混匀，室温避光孵育15min后加入5μLPI，室温避光孵育10min，染色结束后流式检测。白血病原代细胞分离采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，分离出的原代细胞培养于含20%胎牛血清,1%双抗和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养待用。结果显示17-DMAG诱导白血病细胞株凋亡，凋亡率与药物浓度呈正相关，见附图3。17-DMAG能够诱导患儿来源的白血病细胞发生凋亡，见附图4。实施例3.17-DMAG与阿糖胞苷联合处理白血病细胞株实验。Nalm6和Reh细胞重悬为3×105ml，给予17-DMAG10μM，阿糖胞苷（Ara-C，8nM），及17-DMAG与阿糖胞苷联合处理，48h后检测白血病细胞凋亡，凋亡检测方案同实施例2。结果显示17-DMAG与阿糖胞苷联合处理组细胞凋亡明显增加，高于17-DMAG和阿糖胞苷单药处理组，见附图5。实施例4.17-DMAG联合依托泊苷柔红霉素处理Nalm6、Reh细胞实验。17-DMAG10μM，依托泊苷（1uM），柔红霉素（100nM），及17-DMAG与依托泊苷、17-DMAG与柔红霉素联合处理Nalm6和Reh细胞48h后检测细胞凋亡，凋亡检测方案同实施例2。结果显示17-DMAG与两种化疗药物联合处理组细胞凋亡没有明显增加，与17-DMAG，依托泊苷和柔红霉素单药处理组相比没有协同效应，见附图6。实验给予ALL细胞系（Nalm6及Reh）及来自ALL患者的原代白血病细胞17-DMAG药物处理后，发现不但17-DMAG单药可以诱导白血病细胞凋亡，其与阿糖胞苷联用产生协同效应，提高了阿糖胞苷的化疗效果；但实验中将17-DMAG与柔红霉素、依托泊苷分别联合应用则无法收到类似效果，换言之17-DMAG与柔红霉素联用和17-DMAG与依托泊苷联用均无法协同诱导白血病细胞凋亡。以此为基础确立了17-DMAG联合阿糖胞苷的化疗方案在儿童ALL化疗中的合理应用提供了依据，为提高白血病患者化疗效果，改善耐药提供了可能性。本发明首次提出在儿童ALL中，17-DMAG和阿糖胞苷作为活性成分在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

权利要求：1.一种Hsp90抑制剂17-DMAG在制备抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物中的应用，其特征在于，所述抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物以Hsp90抑制剂17-DMAG和阿糖胞苷作为活性成分。2.一种抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其特征在于，包括含有治疗量的Hsp90抑制剂17-DMAG和阿糖胞苷，以及药学上的载体或者赋形剂。3.一种Hsp90抑制剂17-DMAG在儿童ALL联合化疗中与一线化疗药物联用从而增加一线化疗药物杀伤的方法，所述一线化疗药物为阿糖胞苷。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Hsp90抑制剂17-DMAG能够促进白血病细胞凋亡，并促进了阿糖胞苷诱导的细胞凋亡。5.根据权利要求2所述的抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其特征在于，所述Hsp90抑制剂17-DMAG为任何药物治疗学上可接受的剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂，优选剂型为注射制剂。6.根据权利要求2所述的抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其特征在于，所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。7.根据权利要求2所述抑制儿童急性淋巴细胞白血病药物，其特征在于，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型，优选剂型为注射制剂。

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