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申请/专利权人：淮海工学院;江苏省海洋资源开发研究院(连云港)

摘要：本发明公开了一种来自海洋的天目不动杆菌MCDA01Acinetobacterschindleri，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13538，该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，菌落白色、不透明，表面光滑湿润，稍有突起，菌落边缘有小锯齿状，菌株在最适生长温度为30℃，最适生长pH为8.0，最适生长的NaCl浓度为4％，MCDA01菌株所产的几丁质脱乙酰酶的最适发酵pH为8.0，最适温度为30℃；本发明制备的几丁质脱乙酰酶在低温时具有较高活性，工业应用中可以节约能量和费用，利用该酶催化准备的壳聚糖具有脱乙酰度高、生物酶法绿色环保，实现了壳聚糖的绿色生产，具有很大的经济效益。

主权项：1.一种天目不动杆菌MCDA01，其特征在于，该菌株为天目不动杆菌AcinetobacterschindleriMCDA01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13538。

全文数据：一种天目不动杆菌MCDA01及其制备几丁质脱乙酰酶的方法技术领域本发明涉及一种微生物，是一种来自海洋的天目不动杆菌，特别是一种天目不动杆菌MCDA01及其制备几丁质脱乙酰酶的方法。背景技术几丁质又叫甲壳素、甲壳质，是天然有机化合物中仅次于纤维素含量的物质，广泛存在于无脊椎动物的外骨骼及表皮和真菌及藻类的细胞壁中。几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键连接而成的直链大分子物质，不溶解于水和有机溶剂，不容易被广泛的开发利用。如几丁质脱乙酰度超过55％便可得到壳聚糖，随之其溶解性增加，并具有抗癌、降低胆固醇、降血压等生物活性，可广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等行业，有很高的应用价值和开发前景。目前，几丁质转化为壳聚糖的处理方法有化学热碱法和生物酶法两种，其中，化学热碱法存在反应时间长、用碱量大、成本高的缺陷，存在污染环境的危害，并且由于化学热碱发处理其脱乙酰度不易控制而导致产品质量不稳定，不适于大规模生产。此外，生物酶法主要采用几丁质脱乙酰酶来酶解几丁质获取壳聚糖，但目前微生物制备几丁质脱乙酰酶存在产酶活力低、脱乙酰效果差等问题，急需扩大对产几丁质脱乙酰酶生微生物资源的筛选，满足壳聚糖生物酶法工业化生产需要。发明内容为了针对上述的化学热碱法存在的如不环保、产品稳定性差、不易控制和生物酶解法存在的酶活性低、脱乙酰效果差、成本高等缺陷，本发明提供了一种绿色环保，提高脱乙酰度的几丁质脱乙酰酶的方法，具体方案如下：一种天目不动杆菌MCDA01，该菌株为天目不动杆菌AcinetobacterschindleriMCDA01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13538。进一步的，所述MCDA01为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，菌落白色、不透明，表面光滑湿润，稍有突起，菌落边缘有小锯齿状。一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于，所述天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法具体包括如下步骤：1配制2216E液体培养基、种子培养基、发酵培养基，2将菌株MCDA01接种至2216E液体培养基中斜面种子培养，并用筛选培养基筛选目标菌种，3将上述步骤2中获取的斜面种子接种至种子培养基中进行摇瓶培养，培养完成后将其以1000rmin离心10min，取上清液即为种子液，4将上述步骤3中获取的种子液以1％接种量接种至发酵培养基进行摇瓶培养，制备几丁质脱乙酰酶，5每间隔2h取上述步骤4中样品进行测定几丁质脱乙酰酶活力，其中设置沸水浴灭活15min的酶液对照组。进一步的，所述步骤1中2216E液体培养基组成成分为：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，FePO40.01％，琼脂2％，陈海水配置；种子培养基组成成分为：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，NaCl1％，陈海水配置；发酵培养基组成组分为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，NH4SO40.3％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，粉末几丁质1％，陈海水配制。进一步的，所述步骤2中2216E液体培养基pH值为7.0，斜面培养48h，获得的斜面种子能够使筛选培养基产生黄色圈。进一步的，所述步骤3中种子液摇瓶培养条件为装液量20％，转速为180rmin，温度5℃-45℃，pH值为3.0-11.0，NaCl浓度为0％-10％，时间为0-24h。进一步的，所述步骤4中发酵培养条件为装液量20％，发酵时间2h-96h，温度10℃-30℃，发酵起始pH值为4.0-10.0，诱导剂1％-5％。进一步的，所述步骤2中筛选培养基为pH值为7.0的组分为胶体几丁质0.2％，K2HPO40.07％，KH2PO40.03％，MgSO40.05％，对硝基-N-乙酰苯胺0.02％，陈海水配置。进一步的，所述步骤5中酶活力的鉴定，试管中加入30℃预保温的0.05molL、pH值为7.0磷酸缓冲液3mL，200mgL的对硝基乙酰苯胺水溶液1mL，酶液1mL，于30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000rmin离心10min，测定上清液的吸光度。本发明与现有技术相比，有如下优点：本发明涉及的菌株是在中国黄海海州湾海域的海泥中分离到的天目不动杆菌MCDA01，来源广泛，在含有胶体几丁质和对硝基-N-乙酰苯胺的筛选培养基上能够产生黄色圈，不发酵葡萄糖产气，在NaCl浓度为0％-10％生长，属于耐盐海洋微生物，利用其进行发酵制备几丁质脱乙酰酶，其在在低温时具有高活性，常温下催化活性更高，MCDA01发酵制备的几丁质脱乙酰酶，可实现大规模工业化生产，满足市场对的壳聚糖的需求，不仅脱乙酰度高，无污染物质排放，达到绿色生产的目的，而且保护了环境，降低生产成本，提高经济效益。附图说明图1为菌株MCDA01革兰氏染色体×1000；图2为菌株MCDA01在初筛平板形成的变色圈图；图3为温度对菌株MCDA01生长的影响图；其中，●5℃，○15℃，▼25℃，■30℃，▲45℃；图4为pH对菌株MCDA01生长的影响图；图5为NaCl浓度对菌株MCDA01生长的影响图；图6为发酵时间对菌株MCDA01发酵产酶的影响图；图7为温度对菌株MCDA01发酵产酶的影响图；图8为培养基初始pH对菌株MCDA01发酵产酶的影响图；图9为装样量对菌株MCDA01发酵产酶的影响图；图10为粉末几丁质添加量对菌株MCDA01发酵产酶的影响；图11为温度对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶活性的影响；图12为温度对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶稳定性的影响；其中，●4℃，○15℃，▲25℃，▼30℃；图13为pH对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶活性的影响，其中，▲pH5.0-pH8.0，●pH8.0-pH9.0，○pH9.0-pH12.0；图14为pH对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶稳定性的影响，其中，▲pH5.0-pH8.0，●pH8.0-pH9.0，○pH9.0-pH12.0。生物材料样品保藏：天目不动杆菌MCDA01Acinetobacterschindleri已经于2017年1月6号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenterCGMCC，保藏编号为CGMCCNO.13538，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。具体实施方式为进一步揭示本发明的技术方案，下面结合附图详细说明本发明的实施方式：其中，本发明中所用的培养基为：2216E液体培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，FePO40.01％，琼脂2％，陈海水配置，pH7.0；筛选培养基：胶体几丁质0.2％，K2HPO40.07％，KH2PO40.03％，MgSO40.05％，对硝基-N-乙酰苯胺0.02％，陈海水配置，pH7.0；种子培养基：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，NaCl1％，陈海水配置，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，NH4SO40.3％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，粉末几丁质1％，陈海水配制，pH8.0。实施例1：一MCDA01的特性形态上，该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，如图1所示。在LB固体培养上培养48h后，菌落呈白色不透明状，其表面光滑湿润，稍有突起，该菌落边缘有小锯齿状、不易挑取。在含有胶体几丁质和对硝基-N-乙酰苯胺的筛选培养基上能够产生黄色圈，参见图2。所述MCDA01具有生理生化特性，如表1所示：表1MCDA01菌株的生理生化试验结果注：+：阳性；-：阴性；二MCDA01的培养：将菌株MCDA01的2216E斜面种子接种到种子培养基中进行摇瓶培养，其中控制温度30℃，转速180rmin，装液量20％，培养24h。为了进一步的探究温度对菌株MCDA01生长的影响，将种子液以1％的接种量接于2216E液体培养基中，在转速180rmin、装液量为20％条件下，分别在不同温度下培养24h，然后测定其OD600的值。由图3可知，该菌株在低于5℃和高于45℃生长速度显著降低，最适生长温度为30℃。为了进一步探究pH值对菌株生长的影响，在pH3.0-pH11.0范围、温度控制在30℃，其余条件上，对MCDA01进行摇瓶培养，发现该菌在pH6.0-pH9.0范围内生长良好，最适生长pH为8.0，参见图4。为了进一步探究NaCl浓度对菌株生长的影响，本发明用蒸馏水配置2216E培养基，控制NaCl范围为0％-10％，然后接种该菌在最适温度和pH条件下培养，发现该菌在0％-10％的NaCl浓度范围内可以生长，最适生长的NaCl浓度为4.0％，无NaCl有一定生长，属于耐盐海洋微生物，参见图5。三发酵MCDA01制备几丁质脱乙酰酶：将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，其中温度30℃、装液量20％、摇瓶转速为180rmin进行发酵96h，每隔2h取样测酶活力，结果表明72h产酶最高，参见图6。为了进一步探究发酵温度对菌株MCDA01产酶的影响，本发明将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，其中装液量为20％、摇瓶培养转速为180rmin，在不同温度下进行培养72h，结果显示25℃时酶产量达到最高，15℃时有较高的产酶量，达到最高产酶的80％，参见图7。为了进一步探究培养基起始pH对菌株MCDA01产酶的影响，本发明将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，控制发酵条件为温度25℃、装液量20％、摇瓶发酵转速为180rmin，调节发酵培养基不同初始pH，培养72h后测定酶活力，结果表明，随着初始pH的升高酶产量逐渐增加，当pH达到8.0时产酶量达到最大，低于pH5.0或高于pH10.0时酶产量显著降低，参见图8。为了进一步探究装液量对菌株MCDA01产酶的影响，本发明将种子液以1％接种量接种至不同装液量发酵培养基，其中发酵条件为温度25℃、转速为180rmin，培养72h后测定酶活力，结果显示250mL三角瓶中装液量在20％时产酶最高，参见图9。为了进一步确定诱导剂对菌株MCDA01产酶的影响，本发明将种子液以1％接种量接种至不同几丁质含量的发酵培养基，控制发酵条件为温度25℃、装液量20％、转速为180rmin，培养72h后测定酶活力，几丁质添加量为1％-5％时产酶量达到最大值，低于1％或高于5％时，产酶显著降低，考虑到经济原因，选择1％，参见图10。四几丁质脱乙酰酶活性测定方法：试管中加入30℃预保温的0.05molLpH7.0磷酸缓冲液3mL，200mgL的对硝基乙酰苯胺水溶液1mL，酶液1mL，于30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000rmin离心10min，测定上清液的吸光度。以添加1mL同样浓度沸水浴灭活15min的酶液为对照。其中，酶活单位U定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。首先，温度对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响：在pH7.0，0.05mmolL磷酸缓冲液中于不同温度下测定纯化几丁质脱乙酰酶活力，确定酶的最适合作用温度，结果见图11，酶的最适合作用温度是30℃，在15℃和45℃仍保持50％以上相对酶活。将几丁质脱乙酰酶在pH7.0，0.05molL磷酸缓冲液中分别于不同温度下分别保温0h-2.5h，然后测定残余酶活力，确定酶温度稳定性，结果见图12，酶在4℃时最稳定，25℃的半衰期为1.5h。其次，pH对菌株MCDA01几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响：配制不同pH的0.05moll缓冲液，磷酸缓冲液pH5.0-pH8.0，Tris-HCl缓冲液pH8.0-pH9.0，Gly-NaOH缓冲液pH9.0-pH12.0。在30℃于不同pH的缓冲液下以对硝基乙酰苯胺为底物测定酶的活力，结果见图13，酶的最适pH为8.0，在pH7.0-pH10.0具有80％以上酶活性。将酶在不同pH的缓冲液中分别于30℃保温1h，然后在30℃于pH7.0磷酸缓冲液中测定残余酶活力。结果见图14，酶在在pH7.0-pH10.0具有80％以上响度酶活，在pH10.0保持40％以上酶活性，在酸性条件下，酶活性显著降低。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

权利要求：1.一种天目不动杆菌MCDA01，其特征在于，该菌株为天目不动杆菌AcinetobacterschindleriMCDA01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13538。2.一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述天目不动杆菌MCDA01选自保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13538的天目不动杆菌AcinetobacterschindleriMCDA01，具体步骤如下：1配制2216E液体培养基、种子培养基、发酵培养基，其中2216E液体培养基组成分为：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，FePO40.01％，琼脂2％，陈海水配置；种子培养基组成成分为：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，NaCl1％，陈海水配置；发酵培养基组成组分为：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，NH4SO40.3％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，粉末几丁质1％，陈海水配制；2将菌株MCDA01接种至步骤1中的2216E液体培养基中斜面种子培养，并用筛选培养基筛选目标菌种，3将上述步骤2中获取的斜面种子接种至种子培养基中进行摇瓶培养，培养完成后将其以1000rmin离心10min，取上清液即为种子液，4将上述步骤3中获取的种子液以1％接种量接种至发酵培养基进行摇瓶培养，制备几丁质脱乙酰酶，5每间隔2h取上述步骤4中样品进行测定几丁质脱乙酰酶活力，其中设置沸水浴灭活15min的酶液对照组。3.根据权利要求2所述的一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述步骤1和2中2216E液体培养基pH值为7.0，斜面培养48h，获得的斜面种子能够使筛选培养基产生黄色圈。4.根据权利要求2所述的一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述步骤3中种子液摇瓶培养条件为装液量20％，转速为180rmin，温度5℃-45℃，pH值为3.0-11.0，NaCl浓度为0％-10％，时间为0-24h。5.根据权利要求2所述的一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述步骤4中发酵培养条件为装液量20％，发酵时间2h-96h，温度10℃-30℃，发酵起始pH值为4.0-10.0，选用1％-5％的几丁质为诱导剂。6.根据权利要求2所述的一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述步骤2中筛选培养基组分为：胶体几丁质0.2％，K2HPO40.07％，KH2PO40.03％，MgSO40.05％，对硝基-N-乙酰苯胺0.02％，陈海水配置，所述筛选培养基pH值为7.0。7.根据权利要求2所述的一种天目不动杆菌MCDA01制备几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于：所述步骤5中酶活力的鉴定，试管中加入30℃预保温的0.05molL、pH值为7.0磷酸缓冲液3mL，200mgL的对硝基乙酰苯胺水溶液1mL，酶液1mL，于30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000rmin离心10min，测定上清液的吸光度。

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