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申请/专利权人：西北农林科技大学

摘要：本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测人工核酸酶诱导Indels突变检测系统的构建与应用。采取的具体技术方案为：提供一种ara‑mFabI检测系统，包括3个检测载体，每个载体单独负责一种类型插入片段的定量与定性揭示。3个载体的区别在于：mFabI基因开放阅读框的类型不同；分别由mFabI基因扩增引物的上游引物分别引入9、10、11个碱基以改变mFabI基因的ORF。使用本发明提供的检测系统，能实现核酸酶诱导的各类型Indels突变频率的定量揭示；并能达到与扩增子测序相近的Indels突变频率与类型分布。

主权项：1.一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的系统，其特征在于：所述系统包括pmF1载体，所述pmF1载体的序列如SEQIDNO1所示。

全文数据：一种核酸酶诱导Indels的高通量检测系统的构建及应用技术领域本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的系统及构建方法与应用。背景技术核酸酶依赖的基因编辑工具正以极高的精度和高通量迅速影响和改变细胞、生物体的基因组，在基因组编辑领域具有广泛的应用前景。尤其是以Ⅱ型sgRNA导向的CRISPRCas9核酸酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPRCRISPR-associatedprotein-9nucleaseCas9为基础的编辑系统，因其设计简单、功能高效，被大量使用。人工核酸酶ZFNs、TALENs、CRISPRCas等均可在特定靶基因位点诱导DNA双链断裂doublestrandbreaks,DSBs，通常在无修复模板提供时，会经非同源末端连接修复non-homologousendjoining,NHEJ，导致靶位点附近产生插入与缺失Insertionsanddeletions,Indels突变。NHEJ修复的普遍性与高效性，及其在目标基因位点引入突变的多样性，使检测和表征靶基因突变成为评估核酸酶靶向基因组编辑有效性和特异性至关重要途径，及体内基因功能研究的重要依据。然而，相较于对基因组编辑工具的优化和修复途径的定向提高，致力于具体靶位点与潜在脱靶位点Indels的检测和表征方法上关注较少。而今主要以高通量测序或称新一代基因测序Next-generationsequencingtechnology，NGS作为该领域的“黄金标准”。尽管测序手段与策略、数据分析等均有较明显的改进，但其整个的测序与分析过程仍然是高成本、长周期、数据分析困难的，并不适用于大多数普通实验室。因此，检测和表征靶基因突变领域需要得到更多的关注与发展。现阶段关于核酸酶诱导Indels突变检测有多种方法，基本策略主要有：1借助扩增子扩增过程引物的特异性结合能力，退火温度对产物合成的影响，依据产物的扩增量显示Indels产生频率；2借助扩增子池的序列非单一性，经快速变性与退火过程形成迁移速率，熔解曲线差异的异源双链，依据电泳条带大小、强度，熔解曲线变化情况显示Indels产生情况；3或借助特定核酸内切酶对DNA双链特定序列或特殊结构酶切活性检测Indels产生。尽管这些方法在Indels的定量检测，核酸酶工作效率的评估上具有积极的推动作用，但在检测的通量，Indels的定性研究上缺乏系统的检测与评估，这对于knock-out介导的基因功能研究是至关重要的。NHEJ介导的Indels引入可能会因人工核酸酶系统，细胞类型，基因位点选择等不同而表现出极高的多样性与不确定性，当缺失或插入的碱基数为3的倍数时，并未产生框移frame-shifted突变而破坏蛋白质功能。因此，为更好地揭示某一基因在不同细胞或生物体的具体功能，需要借助一些方法在揭示特定位点Indels突变频率的同时识别出突变类型，在实现有效核酸酶功能活性揭示的同时，为特定基因的功能揭示提供更具体的研究与分析依据。发明内容本发明的目的是提供一种高通量Indels检测系统，实现Indels高通量准确定量，为人工核酸酶基因组编辑系统的细胞内活性与工作效率的初步评估提供数据支持。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：借助原核阿拉伯糖操纵子，实现在L-阿拉伯糖诱导下的，以mFabI基因的开放阅读框Openreadingframe,ORF完整性为检测依据的Indels高通量检测系统。具体为：一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的系统，所述系统包括pmF1载体，所述pmF1载体的序列如SEQIDNO1所示。相应的，所述系统包括pmF2载体和pmF3载体，所述pmF2载体和pmF3载体，分别为在所述pmF1载体的基础上，于mFabI基因前多引入1个和2个碱基。相应的，所述构建方法包括如下步骤：1将pET28a表达载体中的T7启动子更换为来源于pKD46表达载体的阿拉伯糖启动子，并引入araC基因；2扩增mFabI基因，并经KpnI与XhoI内切酶将其引入阿拉伯糖启动子后的多克隆位点，于93位氨基酸处引入突变甘氨酸到缬氨酸的突变，得到pmF1载体。相应的，一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的方法，利用所述pmF1载体进行；或同时利用所述pmF1载体、pmF2载体和pmF3载体进行。优选的，所述方法包括如下步骤：1靶基因序列扩增：对待检测基因序列进行PCR扩增，获得含待检测基因靶位点信息的扩增产物；2待检测基因基因序列克隆与转化：将所述扩增产物片段与所述pmF1载体、pmF2载体、pmF3载体同时进行酶切、回收、连接化BL21电转感受态；电转后，将获得的各菌液复苏，并分别涂布于K板和K+ara+Tri板上；3克隆计数和Indels突变型频率计算：分别统计各K板和K+ara+Tri板上克隆数；以各K板上克隆数为转化量，以各K+ara+Tri板上克隆数为阳性筛选量；插入片段mFabI基因ORF恢复的比率＝阳性筛选量转化量，从而实现Indels定量分析。优选的，步骤2所述待检测基因序列为：所述待检测基因序列的总长度为100～200个碱基，且未实现基因组编辑的待检测基因的序列类型为3n，n为自然数。本发明具有以下有益效果：能实现核酸酶诱导的各类型Indels突变频率的定量揭示；并能达到与扩增子测序相近的Indels突变频率与类型分布。附图说明图1为本发明的检测系统工作原理图；图2为本发明的检测系统涉及载体构建流程图；图3为使用本发明的检测系统进行检测的操作流程图；图4为实施例一中酶切后骨架载体与片段的凝胶电泳图；图5为实施例一中对照组转化结果示意图；图6为实施例一Indels频率统计结果示意图；图7为实施例二Indels频率统计结果示意图；图8为实施例三Indels频率统计结果示意图。具体实施方式1、本发明提供的技术方案的核心步骤及工作原理如图1所示，主要原理为：以Indels突变影响基因表达为理论基础，以阿拉伯糖诱导下的mFabI基因表达与三氯生药物筛选为策略依据，以FabIG93V蛋白N端融合多肽的可行性为策略保障。其中，所述FabI基因可以编码细菌烯酰还原酶，所述细菌烯酰还原酶是催化细菌脂肪酸生物合成的关键酶，是以NAD+NADP+为辅基的单功能酶。所述三氯生药物是一种广谱抗菌剂，可以借助NAD+辅基与FabI蛋白形成稳定三元复合物，进而抑制细菌生长。所述FabIG93V蛋白是一个FabI蛋白突变体93位氨基酸发生从Gly到Val的突变，可使细菌具有更强的三氯生抗性，并将编码该突变体的基因记为mFabI基因。本系统，ara-mFabI检测系统，包括3个检测载体，每个载体单独负责一种类型插入片段的定量与定性揭示。3个载体的区别在于：mFabI基因开放阅读框openreadingframe,ORF的类型不同；分别由mFabI基因扩增引物的上游引物分别引入9GGTTCTGGC、10GGGTTCTGGC、11GGGGTTCTGGC个碱基以改变mFabI基因的ORF。其中，所述mFabI基因扩增引物的引物如表1所示。表1mFabI基因扩增引物对照表将这3个载体分别命名为pmF1其基因序列如SEQIDNO1所示、pmF2、pmF3，并组成ara-mFabI检测系统。其中，仅pmF1载体中mFabI基因的ORF是正确的标记为3N型，在L-阿拉伯糖存在时，araBAD启动子激活转录并启动mFabI基因表达，并以外源基因表达的形式赋予宿主菌三氯生抗性。而另外两个载体中mFabI基因的ORF为移码的，分别标记为3N+1型、3N+2型。其中，N为自然数。利用核酸酶编辑系统靶向切割基因组位点，经sgRNA导向Cas9蛋白实现基因组靶位点的切割，经细胞内NHEJ修复在靶位点产生不同类型的Indels突变，获得编辑后的基因组。以编辑后的基因组为模板，设计特异性引物，扩增含靶位点Indels信息的扩增子池。将扩增产物以片段克隆的方式引入araBAD启动子与mFabI基因序列间的多克隆位点multiplecloningsite,MCS。仅当片段序列分别为3n，3n+2，3n+1个碱基时n代表自然数，pmF1、pmF2、pmF3三个载体中打断的ORF得到相应恢复，mFabI基因正常表达,细菌产生三氯生抗性。可通过统计含三氯生筛选培养基上克隆细菌的生长情况，获取特定位点有关缺失与插入的信息，进而通过这一检测系统初步估计核酸酶工作效率，推动knock-out介导的基因功能研究。2、本系统涉及的三个检测载体的具体构建流程如图2所示，具体包括如下步骤：1更换启动子，将原pET28a表达载体购自Addgene中的T7启动子更换为来源于pKD46表达载体购自Addgene的阿拉伯糖启动子以下简称为araBAD，并引入araC基因编码的araC蛋白是araBCAD启动子诱导表达必须的。2从大肠杆菌基因组上扩增mFabI基因FabI基因是细菌内源基因，因此可直接从细菌基因组上扩增；扩增不包含起始密码子，统一由araBAD启动子启动转录与表达，并引入9个碱基的短的连接肽，以实现插入片段与mFabI基因的ORF融合，并经KpnI与XhoI两个内切酶将其引入araBCAD启动子后，再通过overlapPCR引物于93位氨基酸处引入突变G到V的突变，得到检测载体pmF1。3在pmF1载体的基础上，于mFabI基因前多引入1个和2个碱基即连接肽分别为10个和11个碱基以打断mFabI基因的ORF，即得到载体pmF2，pmF3，由此3个表达检测载体组成了Indels的高通量检测系统，即ara-mFabI。3、本系统的检测过程及操作流程如图3所示，具体包括如下步骤：1靶基因序列扩增选择适宜的靶基因序列进行PCR扩增扩增体系与步骤对应实施例一中的表1、2，并回收扩增产物，得到包含靶位点信息的回收产物。所述适宜的靶基因序列的选择方法为：所述靶基因序列的总长度选择100～200个碱基，且野生型靶基因未发生基因编辑的的序列类型为3n，即3的倍数。所述靶基因序列的组成包括整个基因靶位点即sgRNA序列，其间不出现任意一个终止密码子的组合；靶位点前的序列不包含on-frame的起始密码子和终止密码子，以保证野生型靶基因克隆进MCS时整个ORF正确；靶位点后的序列长度为15～20bp，不可出现任意一个终止密码子组合以及on-frame的起始密码子。2靶基因序列克隆与转化将片段插入ara-mFabI检测系统对回收扩增产物片段与所述的3个载体pmF1、pmF2、pmF3同时进行酶切SacIKpnI,37℃水浴4h、回收、连接16℃，4h转化BL21电转感受态感受态制备参照分子克隆实验指南第四版，电转参数：1800v,6ms。电转后，将获得的菌液于无抗未加抗生素的液体培养基中复苏37℃摇床，180rpm复苏40min，将同一复苏菌液分别取50μL涂布于含卡那抗生素的固体培养基以下简称K板上和含卡那抗生素、L-阿拉伯糖诱导剂、三氯生筛选剂的固体培养基上以下简称K+ara+Tri板。即每个连接转化组分别设置K板和K+ara+Tri板组别按3个检测载体形成的克隆骨架区分，并将连接转化组分别表示为pmF1+F组,pmF2+F组,pmF3+F组，此处的F代表扩增靶基因序列。其中，所述液体培养基100mL：1gNaCl、1g蛋白胨、0.5g酵母浸粉。所述固体培养基在液体培养基的基础上增加1.5g琼脂粉。K板：在所述固体培养基中加卡那抗生素并使其终浓度为50μgmL。K+ara+Tri板：在所述固体培养基中加卡那抗生素并使其终浓度为50μgmL，加L-阿拉伯糖使其终浓度为10μM,加由DMSO溶解的三氯生使其终浓度1μM。培养基均经高压120℃灭菌20min,并降温至55℃后再分别加入抗生素与诱导剂。液体培养基于4℃保存，K板和K+ara+Tri板在加抗生素与诱导剂后，分装、冷却、4℃保存。注意：DMSO溶解的三氯生需避光室温保存。3克隆计数和Indels突变型频率计算。分别统计各连接转化组情况即各组K板和K+ara+Tri板上克隆数。以各K板上克隆数为转化量即50μL菌液中有多少菌被电转进了重组质粒，一般细菌转化为单质粒转化，即一个菌只会进一个重组质粒，以各K+ara+Tri板上克隆数为阳性筛选量即在同样的50μL菌液中有多少菌具有三氯生抗性，从而可以看出，在电转进菌体的重组质粒中有多少是mFabI基因表达恢复的。因此，后者较前者的克隆数相对值即为插入片段mFabI基因ORF恢复的比率，即插入的核酸酶靶基因扩增子混合池中3n、3n+2、3n+1型序列各自所占比例，即反应了各Indels突变类型的比例，从而实现Indels定量分析。关于Indels突变类型的原理说明：ara-mFabI检测系统中的3个载体一对一的负责3种插入片段的类型揭示。即pmF1载体负责揭示3n型片段,pmF2负责揭示3n+2型片段,pmF3负责揭示3n+1型片段。由于pmF1载体中mFabI的ORF为3N，当插入片段为3n时，mFabI与插入片段融合的ORF仍然是3的倍数这是蛋白实现表达最根本的依据，而当插入片段为其他两种类型时，以pmF1载体为克隆骨架是不能实现mFabI诱导表达的，也是不具有三氯生抗性的。依此类推，以pmF2载体pmF2载体中mFabI是被打断移码的，不具有正确的ORF为克隆骨架，仅当插入片段为3n+2时，打断的ORF能被恢复成3的倍数，实现mFabI诱导表达，进而赋予宿主菌以三氯生抗性，在K+ara+Tri板上有克隆生长被筛选。以pmF3载体pmF3载体中mFabI是被打断移码的，不具有正确的ORF为克隆片段的骨架，仅当插入片段为3n+1时，打断的ORF能被恢复成3的倍数，实现mFabI诱导表达，进而赋予宿主菌以三氯生抗性，在K+ara+Tri板上有克隆生长被筛选。4阳性单克隆测序确认从每个K+ara+Tri板上随机挑5个单克隆细菌，于加了卡那抗生素的液体培养基中摇菌37℃摇床，250rmp摇菌10～12h，提取质粒质粒提取试剂盒购于Omega生物公司，酶切鉴定，用NanoDrop2000超微量分光光度计测量质粒浓度，并送往杨凌奥科测序公司测序。经单克隆测序进一步确认ara-mFabI系统检测效率与检测的准确性，并与NGS分析结果进行比较，进一步确定ara-mFabI系统检测实用性。下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。实施例一：对CRISPRCas9作用后的293T细胞基因组进行Indels突变检测---不同靶基因位点Indels突变效率＞20％1、构建特异性靶向EMX1、HPRT1、CCR5基因的CRISPRCas9系统并转染293T细胞人胚胎肾细胞。各靶基因的序列如表2所示。表2各靶基因序列对照表具体包括如下步骤：1将经AnnealingPCR扩增的sgRNA序列与基因靶序列分别经BamHINotI和BbsI内切酶位点克隆进sgRNA-Cas9表达载体与NHEJ-RPG报告载体为申请人实验室所有载体，具体构建过程不作详述，获得sgRNA.EMX1-Cas9表达载体、NHEJ-RPG.EMX1报告载体、sgRNA.HPRT1-Cas9表达载体、NHEJ-RPG.HPRT1报告载体、sgRNA.CCR5-Cas9表达载体和NHEJ-RPG.CCR5报告载体。2将所述各表达载体和报告载体分别两两含同一基因名的表达载体和报告载体共转染293T细胞系，转染2天后开始向培养板中加嘌呤霉素所述嘌呤霉素为NHEJ-RPG报告载体中反应核酸酶工作效率的报告基因，所述嘌呤霉素的使用终浓度为3μgmL，经药物筛选3～5天后，回收细胞，并提取基因组基因组提取试剂盒购于广州OMEGA生物公司。3以提取的各基因组为PCR扩增模板，分别以EMX1-FSacI、HPRT1-FSacI、i-CCR5-FSacI为上游引物，以EMX1-RKpnI、HPRT1-RKpnI、i-CCR5-RKpnI为下游引物，扩增EMX1、HPRT1与CCR5靶基因序列，所述各引物序列如表3所示。其中，各引物序列的前3个字母分别表示保护碱基，所述保护碱基后的6个字母分别表示内切酶识别位点。PCR扩增体系、反应步骤分别如表4、5所示。表3各引物序列对应表引物名称引物序列EMX1-FSacIGACGAGCTCGTGAAGGTGTGGTTCCAGAACEMX1-RKpnICGGGGTACCGGAGGTGACATCGATGTCCTCHPRT1-FSacIGACGAGCTCTTTTATTTCTGTAGGACTGHPRT1-RKpnICGGGGTACCGACAATGTGATGGCCTi-CCR5-FSacIGACGAGCTCAAAGCCAGGACGGTCi-CCR5-RKpnICGGGGTACCTGGAAAATGAGAGCTGCAG表4PCR扩增体系反应成分体积总量终浓度DNA模板0.5μL50ng上游引物0.5μL10μM下游引物0.5μL10μMdNTP4μL20μMTaqbuffer10x5μL1xTaqDNA聚合酶0.5μL2.5UpfuDNA聚合酶0.5μL2.5UddH2O38.5μL总体积50μL表5PCR扩增反应步骤与条件表反应步骤温度，时间预变性94℃，5min变性94℃，30s退火58℃，30s延伸72℃，30s充分延伸72℃，10min保存10℃4回收纯化扩增产物：将各PCR产物经1％的琼脂糖凝胶0.2g琼脂粉溶于20mL1xTAE电泳缓冲液中电泳1xTAE电泳缓冲液，电压120v,电泳20min左右后，在紫外灯下照胶，切下目的胶块，经胶回收试剂盒购于Omega生物公司回收扩增产物。2、对回收扩增产物片段与所述的3个载体pmF1、pmF2、pmF3同时进行酶切SacIKpnI,37℃水浴4h。具体为：所述各扩增产物分别经SacI和KpnI酶切后，产生互补的粘性末端；随后再经T4连接酶连接，形成一个环状载体。酶切体系如表6所示。表6酶切体系对应表酶切后骨架载体与片段的凝胶电泳图如图4所示。图中B0、B1、B2分别为pmF1、pmF2、pmF3经SacIKpnI酶切后的条带；C、H、E分别为3个靶基因位点的首字母，为各基因PCR扩增回收后经SacIKpnI酶切后的条带。3、随后回收酶切产物，分别将各酶切产物连接转化BL21电转感受态，获得连接产物，设为实验组。连接条件为16℃，4h；所述感受态制备参照分子克隆实验指南第四版，电转参数：1800v,6ms。所述连接体系如表6所示。同时对应设置对照组具体如表7所示。表7连接体系对照表成分实验组对照组骨架50ngμL1μL50ng1μL50ng片段5ngμL3μL150ng0T4ligase1μL1μL10×T4ligasebuffer1μL1μLddH2O4μL7μL总体积10μL10μL4、靶基因片段连接、转化与检测。取1μL对照组不加片段连接产物，电转BL21感受态1800v，6ms，取1μL实验组连接产物在相同条件下进行电转。电转后，取各组的菌液分别于800μL无抗未加抗生素的液体LB培养基中复苏37℃摇床，180rpm复苏40min，获得复苏后的菌液。将各组的复苏菌液分别布板于K板与K+ara+Tri板上，过夜培养18～20h。对照组转化结果图5所示。K板上仅少量克隆，表明原载体酶切反应彻底，转化背景干净，且K+ara+Tri板上无克隆长出，可排除假阳性的影响所谓的假阳性，是指理论上在筛选板上不应该出现的却出现了克隆，这些克隆混淆在真阳性里，极大的影响了检测的准确度与检测效率。原因可能来自于细菌本身带有三氯生抗性，原质粒载体，如pmF1,酶切反应不完全，错误的转录起始与翻译等。结果表明：该酶切骨架可用于与靶基因扩增片段酶切产物连接与转化。对于实验组，统计各组K板与K+ara+Tri板上生长克隆数，计算各组Indels频率分布情况，具体计算方法如下：1Indels％＝K+ara+Tri板上克隆活菌数K板上克隆活菌数×100％；23n型Indels％＝pmF1+F组的K+ara+Tri板上克隆活菌数同组K板上克隆活菌数×100％；33n+1型Indels％＝pmF3+F组的K+ara+Tri板上克隆活菌数同组K板上克隆活菌数×100％；43n+2型Indels％＝pmF2+F组的K+ara+Tri板上克隆活菌数同组K板上克隆活菌数×100％。挑取Kan+ara+Tri板上筛选克隆、提质粒、酶切。其中，质粒提取操作按照omega质粒小提试剂盒说明书进行。酶切体系如表8所示。表8酶切体系对照表成分待测质粒酶切模板200ngμL2μL内切酶15UμL0.2μL内切酶25UμL0.2μL10×bufferTAKARA1μLddH2O6.6μL总体积10μL鉴定，并送测序，确定筛选克隆阳性率，估计CISPRCas9系统在各位点上的Indels突变效率，并与NGS软件CRISPResso2分析结果进行比对，Indels频率统计结果如表9、图6所示。表9CRISPResso2分析与ara-FabI系统检测Indels频率统计Indels频率％CCR5EMX1HPRT1NGS26.8836.3061.54ara-mFabI28.6128.7864.83其中，NGS表示经CRISPResso2软件分析得到的关于CRISPRCas9核酸酶编辑系统工作后的细胞系基因组扩增子测序中Indels频率统计结果。ara-mFabI栏表示ara-mFabI检测系统检测得到的Indels频率统计结果。表中统计的是3n+1型和3n+2型Indels的总频率因为这两种类型的Indels对于细胞内基因功能的研究极其重要，通常细胞内基因功能的研究以基因敲除或敲低为主要途径，而这两种类型的突变是实现基因敲除或敲低的主要原因。由结果可以看出，本发明所构建的系统在有效揭示Indels突变频率的同时，也实现了与NGS相近的检测效率。实施例二：对未经筛选的293T细胞不同靶基因位点进行Indels突变检测1、分别构建并得到特异性靶向EMX1、HPRT1、CCR5基因的293T细胞系，仅分别单sgRNA.EMX1-Cas9,sgRNA.HPRT1-Cas9,sgRNA.CCR5-Cas9表达载体，以实现不同靶基因位点的基因组编辑，5～7天后收细胞并提取细胞基因组，后续的检测方法与步骤同实施例一。2、Indels频率统计结果如表10、图7所示。表10CRISPResso2分析与ara-FabI系统检测Indels频率统计Indels频率％CCR5EMX1HPRT1NGS4.5115.7317.96ara-mFabI9.1110.9425.63从上述结果可以看出，本发明所构建的系统不仅能有效揭示较高频率＞20％的靶基因Indels突变，也能揭示较低频率5～20％的靶基因Indels突变，且均可与NGS保持较高的相近性。为普通实验室实现快速有效地评估核酸酶活性与编辑效率、促进基因功能研究提供了有效的检测手段。实施例三：对不同细胞系上的CCR5基因位点进行Indels突变检测1、构建得到特异性靶向CCR5基因的293T、A375人黑色素瘤细胞、U2OS人成骨肉瘤细胞细胞，分别单转染sgRNA.CCR5-Cas9表达载体，以实现不同细胞系同一靶基因位点的基因组编辑，5～7天后收细胞并提取细胞基因组，后续的检测方法与步骤同实施例一。2、Indels频率统计结果如表11、图8所示。表11CRISPResso2分析与ara-FabI系统检测Indels频率统计Indels频率％293TA375U2OSNGS4.511.290.62ara-mFabI9.111.080.4由结果可以看出，所构建的系统即使对＜1％的靶基因Indels突变也有一定的揭示作用，且与NGS保持较高的相近性。该结果进一步确定了该系统作为评估核酸酶活性与编辑效率，促进基因功能研究的检测手段是有效的。序列表西北农林科技大学一种核酸酶诱导Indels的高通量检测系统的构建及应用1SIPOSequenceListing1.017370DNApmF11gcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttt60tatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctc120catacccgtttttttgggaattcaataattttgtttaactttaagaaggagatataccat180gggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatat240gaaccaccttggaaaaacggaagtgttcctaaaccgcttcgccctacggcctctgaaccc300cgaggagctcgtcgacggtaccggttctggcggttttctttccggtaagcgcattctggt360aaccggtgttgccagcaaactatccatcgcctacggtatcgctcaggcgatgcaccgcga420aggagctgaactggcattcacctaccagaacgacaaactgaaaggccgcgtagaagaatt480tgccgctcaattgggttctgacatcgttctgcagtgcgatgttgcagaagatgccagcat540cgacaccatgttcgctgaactggggaaagtttggccgaaatttgacggtttcgtacactc600tattgtttttgcacctggcgatcagctggatggtgactatgttaacgccgttacccgtga660aggcttcaaaattgcccacgacatcagctcctacagcttcgttgcaatggcaaaagcttg720ccgctccatgctgaatccgggttctgccctgctgaccctttcctaccttggcgctgagcg780cgctatcccgaactacaacgttatgggtctggcaaaagcgtctctggaagcgaacgtgcg840ctatatggcgaacgcgatgggtccggaaggtgtgcgtgttaacgccatctctgctggtcc900gatccgtactctggcggcttccggtatcaaagacttccgcaaaatgctggctcattgcga960agccgttaccccgattcgccgtaccgttactattgaagatgtgggtaactctgcggcatt1020cctgtgctccgatctctctgccggtatctccggtgaagtagtccacgttgacggcggttt1080cagcatcgctgcaatgaacgaactcgaactgaaataatctagaataaaagcttgcggccg1140cactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaag1200ctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaac1260gggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgc1320gccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac1380acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgtt1440cgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgc1500tttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatc1560gccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggact1620cttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagg1680gattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgc1740gaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcg1800cggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaatta1860attcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattat1920caataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagt1980tccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatac2040aacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtga2100cgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacag2160gccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtg2220attgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaa2280tcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcag2340gatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatg2400catcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagcc2460agtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttca2520gaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcc2580cgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatc2640gcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgt2700ttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttc2760cactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctg2820cgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccg2880gatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca2940aatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccg3000cctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg3060tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctga3120acggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatac3180ctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtat3240ccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcc3300tggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtga3360tgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc3420ctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtg3480gataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgag3540cgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacg3600catctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg3660ccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgcc3720ccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgc3780ttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatc3840accgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcaca3900gatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctg3960gcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctc4020cgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgct4080cacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaaca4140actggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgctt4200cgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccg4260gaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaacc4320gaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgt4380tcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccg4440ggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataat4500ggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc4560gtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcg4620gtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaa4680gaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgac4740tgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaact4800tacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagct4860gcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtgg4920tttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgag4980agagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatgg5040tggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgaga5100tatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatct5160gatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggttt5220gttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgat5280tgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatg5340ggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtc5400gcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaa5460gaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatcca5520gcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctt5580tacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgat5640cggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggagg5700tggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaa5760tgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggc5820tggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacat5880cgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatc5940atgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctccc6000ttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgcc6060gccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcct6120gccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttcc6180ccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccg6240gccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctccccgaaaagtgccacctgcatcgat6300ttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactc6360gctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaa6420accaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgc6480ctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaa6540aagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaa6600attgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccat6660cggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcag6720atttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgccc6780aaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggc6840aaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaaccca6900ctggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgg6960gaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccacccc7020ctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaa7080aaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaa7140cgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgcc7200attcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtctttta7260ctggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaag7320cgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacg7370

权利要求：1.一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的系统，其特征在于：所述系统包括pmF1载体，所述pmF1载体的序列如SEQIDNO1所示。2.根据权利要求1所述的检测人工核酸酶诱导Indels突变的系统，其特征在于：所述系统包括pmF2载体和pmF3载体，所述pmF2载体和pmF3载体，分别为在所述pmF1载体的基础上，于mFabI基因前多引入1个和2个碱基。3.权利要求1或2所述pmF1载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：1将pET28a表达载体中的T7启动子更换为来源于pKD46表达载体的阿拉伯糖启动子，并引入araC基因；2扩增mFabI基因，并经KpnI与XhoI内切酶将其引入阿拉伯糖启动子后的多克隆位点，于93位氨基酸处引入突变甘氨酸到缬氨酸的突变，得到pmF1载体。4.一种检测人工核酸酶诱导Indels突变的方法，其特征在于：利用权利要求1所述pmF1载体进行；或同时利用权利要求2所述pmF1载体、pmF2载体和pmF3载体进行。5.根据权利要求4所述的检测人工核酸酶诱导Indels突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：1靶基因序列扩增：对待检测基因序列进行PCR扩增，获得含待检测基因靶位点信息的扩增产物；2待检测基因基因序列克隆与转化：将所述扩增产物片段与所述pmF1载体、pmF2载体、pmF3载体同时进行酶切、回收、连接化BL21电转感受态；电转后，将获得的各菌液复苏，并分别涂布于K板和K+ara+Tri板上；3克隆计数和Indels突变型频率计算：分别统计各K板和K+ara+Tri板上克隆数；以各K板上克隆数为转化量，以各K+ara+Tri板上克隆数为阳性筛选量；插入片段mFabI基因ORF恢复的比率＝阳性筛选量转化量，从而实现Indels定量分析。6.根据权利要求5所述的检测人工核酸酶诱导Indels突变的方法，其特征在于：步骤2所述待检测基因序列为：所述待检测基因序列的总长度为100～200个碱基，且未实现基因组编辑的待检测基因的序列类型为3n，n为自然数。

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