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申请/专利权人：湖南师范大学

摘要：本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPRCas9基因编辑技术，在斑马鱼的Lgr6基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养60h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉Lgr6基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示骨骼形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上骨骼疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

主权项：1.一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）分别设计CRISPRCas9基因敲除靶位点和检测引物在NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）上查询斑马鱼Lgr6基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http:smart.embl-heidelberg.de）上分析其功能结构域，根据CRISPRCas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeterhttp:zifit.partners.orgZiFiT上设计Lgr6基因的靶位点；两对特异性靶位点PCR引物如下：F1（靶位点a正向引物）：tgTAATACGACTCACTATAgggtcctgtgcccattctcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2（靶位点b正向引物）：tgTAATACGACTCACTATAggtcagatcagttggcacgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物都位于1号外显子上：F5’-AGGCACATACACACAGACAAAC-3’R5’-ATCAAAGTGGATGACAGAAGCG-3’；2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：p42250载体2μL10×Buffer2μLBsaI限制性内切酶1.5μLddH2O14.5μL总体积20μL混匀后于37℃水浴，酶切4h以上；c,以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bpsgRNA上游骨架，反向引物R：20bpsgRNA下游骨架，PCR反应体系（50μL）如下：ddH2O18μL10×Buffer（含20mMMg2+）25μLdNTPs（10mM）1μLPrimerF1（或F2，10uM）2μLPrimerR（10uM）2μL模板（p42250载体）1μLEx-TaqDNA聚合酶1μL总体积50μL震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；具体操作如下：体外转录反应体系：模板DNA12μL10×Buffer2μLrATP（10mM）1μLrUTP（10mM）1μLrCTP（10mM）1μLrGTP（10mM）1μLT7RNA聚合酶2μL总体积20μL将反应物全部加入1.5mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2.5h,向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL的gRNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；；f，特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；3）斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为5ngμL，gRNA的终浓度为30-40ngμL，注射约1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：Cas9mRNA5ngμLgRNA30-40ngμLNucleasefreeH2OTotal3μL；4）Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其Lgr6基因是否存在突变；a,提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精60小时后（60hpf），分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mLEp管中，每管10-15颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃恒温箱中裂解过夜；裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；加入75%乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干8-10min；加入60μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；b，PCR扩增目的序列提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约100-250bp的基因组区域，利用PrimerPremier5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；PCR反应体系如下：2×EsTaqMasterMix10μLPrimerF10μM0.6μLPrimerR10μM0.6μL模板基因组DNA1μLddH2O7.8μL总体积20μL震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；PCR结果进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；c,注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；5）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10-15个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出326bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于326bp的小带；如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体。

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百度查询： 湖南师范大学 一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法