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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了一种水稻粒型基因OsLG1及其编码蛋白和应用，具体涉及分离、克隆、功能验证及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明克隆的基因OsLG1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本发明通过对水稻种子粒型基因OsLG1的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现过量表达OsLG1能一定程度上增加水稻种子长度和粒重，可见该基因在培育高产水稻品种上有一定作用。

主权项：1.SEQIDNO.1所示基因、SEQIDNO.1所示基因编码的蛋白质、含有SEQIDNO.1所示基因的重组表达载体、表达盒或重组菌中的至少一种在培育籽粒变长、粒重增加的转基因水稻中的应用。

全文数据：一种水稻粒型基因OsLGI及其编码蛋白质和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻籽粒发育相关基因OsLGl及其编码蛋白质和应用。背景技术[0002]水稻OryzasativaL.是世界上最重要的粮食作物之一。随着耕地面积的缩小和世界人口的迅速增长，提高水稻的产量对解决未来全球粮食安全危机具有十分重要的意义。水稻产量由每株穗数，每穗粒数及粒重决定。当每株穗数，每穗粒数到达到一个较好的水平时，粒重成为进一步提高产量的目标性状。[0003]许多参与调控水稻粒型发育的基因和QTL已经被报道。GW2是一个控制籽粒宽度的QTLGW2编码一个E3泛素连接酶，通过蛋白酶体对其靶蛋白进行降解，从而负调节细胞的分裂。水稻中GW2功能缺失后不能将泛素标记转移到靶蛋白上，因而使得本应降解的靶蛋白不能被特异识别，进而激活颖花外壳细胞的分裂，从而增加颖花外壳的宽度。另一方面，灌浆速率也得到了提高，胚乳的大小随之也得到了增加，最终谷壳的宽度、粒重以及产量都得到了增加。水稻中一个控制籽粒宽度的QTLGW8,该基因通过影响粒宽，来调控籽粒的形状、大小及品质。利用水稻品种Basmati385供体亲本）和HJX74轮回亲本）构建的近等基因系NIL，最终将GW8定位在第8染色体一个7.5Kb的区间内，该区间内只存在一个ORF，L0C_0s08g419400RF。转基因结果表明，基因启动子区域10-bp的缺失，是导致Basmati385籽粒变窄的原因，进一步的利用酵母系统验证了转录激活结构域位于基因的N端。通过研究GW8与一个控制粒长的QTLGS3的互作并结合QTL聚合的方法，创造了一个品质优良、产量正常的水稻新品种Huabiao1。对115个不同水稻品种的GW8基因序列比对发现，一个来自IRAN的水稻品种Amol在miRNA156结合处插入了两个碱基，将这个发生变异的染色体片段导入到NIL中，构建了一个新的NIUNIL-gW^1。该家系品质优良，产量与HJX74相近，从而创造了一个新的在育种上有潜在利用价值的家系，ΝΙΙ^«8Αμ1^5同样是一个控制籽粒宽度的QTL。GW5编码一个144氨基酸组成的核定位蛋白，该蛋白包含一个核定位信号和一个富精氨酸区域。通过酵母双杂交实验证实GW5与多聚泛素有相互作用，表明GW5可能通过泛素蛋白酶体途径调节粒宽和粒重。因此，GW5可能与GW2有相似的作用。研究人员对近7000份水稻种质资源进行了筛选，找到了一个超级大粒品种N411，将N411与N643杂交构建?2群体，通过QTL鉴定，找到了一个控制籽粒长度的QTLqGL3OsPPKLl，进一步的精细定位将其定位在第三染色体一个46.6-Kb的区间内，通过测序及转基因分析，确定该基因为OsPPKLl。该基因编码区两个碱基的替换，导致了氨基酸的改变。该基因存在Kelch和PP2A两个功能域，通过转基因证明，Kelchdomain的变异，是导致籽粒变大的原因。通过对94份水稻种质资源的基因测序，发现Mll中Kelchdomain的这处变异是特异性的，表明该基因在水稻中是一个罕见的正向调控籽粒大小的基因。通过Blast，在水稻中找到了两个OsPPKLl的等位基因，0sPPKL2和0sPPKL3,转基因结果表明，0sPPKL2是细胞伸长、分裂的正调控因子，而0sPPKLl0sPPKL2是负调控因子。[0004]因此发现并克隆新的调控水稻粒型发育的相关基因，将有助于我们通过基因工程的手段提高水稻产量，缓解粮食危机。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种水稻籽粒大小相关基因OsLGl的核苷酸序列。其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，含4258核苷酸。[0006]本发明的第二个目的还提供所述水稻籽粒大小基因OsLGl编码的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，含有281氨基酸。[0007]所述蛋白质的编码基因优选为如下1或2或3或4所述的DNA分子：[0008]ISEQIDNO.1所示的DNA分子；[0009]2SEQIDNO.2所示的DNA分子；[0010]3在严格条件下与1或2限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；[0011]4与1或2或3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物种子籽粒大小相关蛋白的DNA分子。[0012]含有以上任一所述基因OsLGl的重组表达载体也属于本发明的保护范围。[0013]可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠癭瘤诱导Ti质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。[0014]使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、玉米的泛素启动子Ubiquitin，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。[0015]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。[0016]所述重组过表达载体可为在用限制性内切酶KpnI和SpeI双酶切载体PCAMBIA1390的重组位点插入所述基因（OsLGl得到的重组质粒。将含有OsLGl的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-0sLGl。含有以上任一所述基因（OsLGl的表达盒及重组菌均属于本发明的保护范围。[0017]扩增所述基因（OsLGl全长或任一片段以及T-DNA插入位点验证的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选POEIP0E2、PIP2、PIP3或PCIPC2中的任意一对；其中POEl序列如SEQIDNO.4所示，P0E2序列如SEQIDNO.5所示，Pl序列如SEQIDNO.6所示，P2序列如SEQIDNO.7所示，P3序列如SEQIDNO.8所示，PCl序列如SEQIDNO.9所示，PC2序列如SEQIDNO.10所示。[0018]有益效果：[0019]本发明的水稻籽粒大小相关基因影响水稻种子的形状、大小和粒重。过表达该位点基因可导致种子籽粒变长，粒重增加。所述位点及其编码基因可以应用于植物遗传改良，以获得籽粒变长、粒重增加的转基因水稻植株。附图说明[0020]图1为亲本Dongjin、Dongjin背景T-DNA插入突变体T250种子大小表型分析及数据统计。[0021]A图Unhulled代表未去壳的种子，Hulled代表去壳的种子。图中标尺为5mm。[0022]B，C，D，E图为未去壳种子的粒长（Grainlength，粒宽（Grainwidth，粒厚Grainthickness及千粒重（I,000-grainweight数据测量统计分析柱状图。mm，长度单位毫米的英文缩写，g，重量单位克的英文缩写。[0023]〇，!1，1，】图为去壳种子的粒长6抑;[11161^1:11，粒宽6抑;[11¥丨11:11，粒厚6抑;[11thickness及千粒重（I,000-grainweight数据测量统计分析柱状图。mm，长度单位毫米的英文缩写，g，重量单位克的英文缩写。[0024]图2为T-DNA插入位置验证图。[0025]A图为T-DNA插入的基因（OsLGl在染色体上位置和T-DNA插入位点在所述基因OsLGlDNA结构中的位置示意图。[0026]B图为插入位点验证电泳图。[0027]图3为过表达载体pCAMBIAl390质粒图谱。[0028]图4为转基因过表达植株的种子大小表型分析。Dongjin为亲本，T250为Dongjin背景T-DNA插入突变体，0E-3、0E-5和0E-12为过表达所述基因（OsLGl三个不同家系植株上收获的种子。Unhulledseeds代表未去壳的种子，Hulledseeds代表去壳的种子。图中标尺为5mm〇具体实施方式[0029]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。[0030]实施例1、水稻控制籽粒大小基因OsLGl及其编码基因的发现[0031]一、水稻籽粒大小相关突变体的筛选[0032]通过对近500份水稻品种Dongjin的T-DNA插入突变体进行鉴定，我们得到了多个水稻籽粒大小发生变化的突变体。从中选择编号为T250的材料做一步研究，即本专利中所保护的水稻籽粒大小基因OsLGl的突变体材料。[0033]从图1中的A图可以看出，突变体T250的种子与野生型Dongjin相比，明显变长。进一步的统计学分析表明，突变体的粒长，粒宽，粒厚与野生型均有一定程度增加，特别是粒长图1中的B和G图）差异显著，并且千粒重也明显提高（图1中的E和J图）。[0034]二、水稻籽粒大小基因OsLGl的T-DNA插入位点验证[0035]根据相关数据库提供的信息，突变体T250中，T-DNA载体插入的基因位于水稻第二染色体末端（图2A，即本专利中所述基因OsLGl。该T-DNA载体插入到了OsLGl第五外显子的起始位置图2A。[0036]为了验证突变体T250中该T-DNA插入是否真实存在，根据相关数据库提供的侧翼序列信息和T-DNA插入位点附近基因OsLGl的DNA序列信息（SEQIDNO.1，设计了三条引物P1SEQIDN0.6、P2SEQIDN0.7和P3SEQIDN0.8，通过引物组合P1+P2和P1+P3,分别以野生型Dongjin和突变体T250的DNA为模板，进行PCR扩增，经电泳，结果如图2B所示，确定了T-DNA插入在突变体T250中真实存在且与数据库提供的信息一致。[0037]上述分析过程的具体方法如下所述：[0038]1提取上述野生型Dongjin和突变体T250的总DNA作为模板，具体方法如下：[0039]①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.OmlEppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GEN0GRINDER仪器上粉碎样品lmin〇[0040]②加入660μ1提取液（含IOOmMTris-HclPH8.0，20mMEDTAPH8.0，1·4ΜNaCl，0.2gmlCTAB的溶液），漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。[0041]③加入40μ120%SDS，65°C温浴lOmin，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。[0042]④加入ΙΟΟμΙ5MNaCl，温和混匀。[0043]⑤加入ΙΟΟμΙ10XCTAB，65°C温浴lOmin，间断轻轻上下颠倒混匀。[0044]⑥加入900μ1氯仿，充分混勾，12000rpm离心3min〇[0045]⑦转移上清液至1·5mLEppendorf管中，加入600μ1异丙醇，混勾，12000rpm离心5min〇[0046]⑧弃上清液，沉淀用70%体积百分含量乙醇漂洗一次，室温凉干。[0047]⑨加入ΙΟΟμΙIXTE121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液溶解DNA。[0048]⑩取2μ1电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度BeckmanInstrumentInc.U.S.A〇[0049]2将上述提取的DNA稀释成约20ngAU，作为模板进行PCR扩增；[0050]PCR反应体系：DNA20ngul2ul，引物PllOpmolul2ul，引物P2lOpmolul2ul，引物P3lOpmolul2ul，IOxBufferMgCl2free2ul，dNTPIOmM0·4ul，MgCl225mMI·2ul，rTaq5uul0·4ul，ddH2〇IOul，总体积20ul。[0051]PCR反应程序：94.0°：变性5111丨11;94.0°：变性3〇8、55°：退火3〇8、72°：延伸1111丨11，共循环35次;72°C延伸7min;10°C保存。PCR反应在MJResearchPTC-225热循环仪中进行。[0052]3引物设计[0053]根据侧翼序列信息和T-DNA插入位点附近基因OsLGl的DNA序列信息（SEQIDN0.1，利用PrimerPremier5.0软件设计T-DNA插入位点验证引物PlSEQIDΝ0·6、Ρ2SEQIDNO.7和Ρ3SEQIDNO.8，并由上海英骏生物技术有限公司合成。将自行设计引物，按照引物组合P1+P2和P1+P3，等比例混合，检测其在Dongjin和T250之间的PCR扩增结果。[0054]⑷PCR产物检测：[0055]扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。以2000bp的DNAMarker为对照比较扩增产物的分子量大小，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。[0056]三、水稻籽粒大小基因OsLG1的获得[0057]PCR扩增所用引物序列如下所述：[0058]PC1：[0059]5’一AAGCCATCACAAAACCAGAGAC—3’（SEQIDN0.9[0060]PC2：[0061]5’一GGTATTTTCCTATTTCCTAACATCG—3’（SEQIDN0.10[0062]以PCl和PC2为引物，以Dongjin的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于SEQID勵.2上游-123?至-10^?和下游278?至302?，扩增产物包含了该基因的全部编码区。[0063]扩增反应用KOD酶扩增（购自Τ0Υ0Β0公司），在PTC-200MJResearchInc.PCR仪上进行：941€2111丨11;98°：10863,551€30863,681€2111丨11，35个循环；681€5111丨11。？〇?产物纯化回收，按试剂盒北京Tiangen公司）步骤进行。PCR产物回收纯化后连接到载体pMbl8T载体上购自TAKARA公司），转化大肠杆菌DH5a感受态细胞购自Tiangen公司），挑选阳性克隆，进行测序。[0064]序列测定结果表明，PCR反应获得的片段包含SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，编码281个氨基酸残基组成的蛋白质（见SEQIDNO.3。将SEQIDNO.3所示的蛋白命名为OsLGlDongjin〇[0065]实施例2、转基因植物的获得和鉴定[0066]一、重组过表达载体构建[0067]以Dongjin的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsLGlDongjin基因，PCR引物序列如下：[0068]POEl下划线所示的序列为KpnI重组位点）：[0069]5’一CGGGGTACCCCGATGATGGATGGGCGAGGAAG—3’（SEQIDNO.4[0070]P0E2下划线所示的序列为SpeI重组位点）：[0071]5'—GGACTAGTCCTTATAATCTTTGCAAGTGTG—3'SEQIDNO.5[0072]上述引物位于SEQIDNO.2所示基因的编码区起始位置和编码区终止子位置，扩增产物包含了该基因的完整编码区，将PCR产物回收纯化。采用In-Fuskm®HDCloningKit重组试剂盒Takara公司将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1390图3中。[0073]In-Fusion重组反应体系（IOyL:PCR产物10-200ng，经KpnI和SpeI双酶切回收pCAMBIA1390载体50_200ng，5XIn-FusionHDEnzymePremix2yL，Deionizedwaterto10yL。枪头吹打混匀后将混合体系50°C反应15min后置于冰上，取2yL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞Tiangen公司）。将全部转化细胞均匀涂布在含100mgL卡那霉素的LB固体培养基上。37°C培养12-16h，挑取克隆阳性克隆，进行测序。[0074]测序结果表明，得到了含有SEQIDNO.2所示OsLGlDongjin基因的重组表达载体，将含有OsLGlDongjin的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-0sLGlDongjin。[0075]二、重组农杆菌的获得[0076]用电击法将pCAMBIA1390-0sLGlDongjin转化农杆菌EHA105菌株购自美国英俊公司），得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1390-0sLGlDongjin。[0077]三、转基因植物的获得[0078]将EH-pCAMBIA1390-0sLGlDongjin转化水稻品种Dongjin，具体方法为：[0079]I28°C培养EH-pCAMBIA1390-0sLGlDongjin16小时，收集菌体，并稀释到含有1ΟΟμπιοIL的N6液体培养基Sigma公司，Cl416中至浓度为OD6qq〜0.5，获得菌液；[0080]⑵将培养至一个月的Dongjin水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤（1的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基N6固体共培养培养基，Sigma公司）中，24°C共培养3天；[0081]⑶将步骤⑵的愈伤接种在含有100mgL巴龙霉素（PhytoTechnologyLaboratories公司）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天）；[0082]⑷挑取健康愈伤转入含有IOOmg!巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；[0083]5挑取健康愈伤转入含有50mgL巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；[0084]⑶挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；[0085]得到分化成苗的To代阳性植株。以Dongjin为阴性对照。[0086]四、转基因植株的鉴定[0087]UPCR分子鉴定[0088]将步骤三获得的T〇代阳性植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用pCAMBIA1390上SEQIDN0.2插入位点左边界附近的引物P0El和SEQIDN0.2上的引物P0E2作为引物对进行扩增P0E1:5’一CGGGGTACCCCGATGATGGATGGGCGAGGAAG—3’（SEQIDNO.4^ΠΡ0Ε2：5'—GGACTAGTCCTTATAATCTTTGCAAGTGTG—3’SEQIDNO.5，扩增长度SeSbpc3PCR反应体系：DNA20ngul2ul，P0EllOpmolul2ul，P0E2lOpmolul2ul，IOxBufferMgChfree2ul，dNTPIOmM0·4ul，MgCl225mMI·2ul，rTaq5uul0·4ul，CldH2OIOul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200MJResearchInc·PCR仪上进行：94°C3min;94°C30sec，551€4586。，72。：1111丨11，35个循环；721€511^11。[0089]用试剂盒北京Tiangen公司）纯化回收PCR产物。PCR产物用I%的琼脂糖电泳检测。[0090]2、表型鉴定[0091]将经上述鉴定获得的To代转EH-pCAMBIA1390-0sLGlDongjin阳性植株、野生型Dongjin和突变体T250种植在南京农业大学水稻试验站，分单株收种，种植三代后，获得T3代转EH-pCAMBIA1390-0sLGlDongjin转基因植株。如图4所示，转入转EH-pCAMBIAl390-OsLGlDongjin的转基因植株籽粒长度明显增加。表1为图4中未去壳的种子的粒长Grainlength、粒宽Grainwidth和百粒重（100-grainweight统计数据。mm，长度单位毫米的英文缩写，g，重量单位克的英文缩写。表2为图4中去壳的种子的粒长Grainlength、粒宽Grainwidth和百粒重（100-grainweight统计数据。mm，长度单位毫米的英文缩写。g，重量单位克的英文缩写。表1和表2的统计分析数据表明，转EH-pCAMBIA139〇-〇SLGlDongjin的转基因植株，籽粒长度和百粒重明显增加，说明过表达OsLGlDongjin确实可以增加籽粒长度，提高粒重。

权利要求：1.一种水稻粒型基因OsLGl，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的水稻粒型基因OsLGl编码的蛋白质，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质的编码基因是如下1或2或3或4的DNA分子：1SEQIDNO.1所示的DNA分子；2SEQIDNO.2所示的DNA分子；3在严格条件下与1或2限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4与1或2或3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码水稻种子休眠性蛋白的DNA分子。4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述根据表达载体是在PCAMBIA1390载体的KpnI和SpeI双酶切位点之间插入权利要求1所述基因得到的过表达基因OsLGl的重组质粒。6.扩增权利要求1所述基因的全长或其任意片段的引物对，其特征在于选自POElP0E2、P1P2、P1P3和PC1PC2中的任意一对；其中POEl序列如SEQID如.4所示，？^2序列如SEQIDNO.5所示，Pl序列如SEQIDNO.6所示，P2序列如SEQIDNO.7所示，P3序列如SEQIDNO.8所示，PCl序列如SEQIDNO.9所示，PC2序列如SEQIDNO.10所示。7.权利要求1所述基因，权利要求2所述蛋白质，权利要求4所述重组表达载体、表达盒或重组菌中的至少一种在水稻育种中的应用;优选在培育籽粒变长，粒重增加的转基因水稻中的应用。8.—种培育水稻长粒，粒重增加，产量提高水稻的方法，是将权利要求1所述基因导入小粒水稻品种中，得到籽粒变长，粒重增加的转基因水稻。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:权利要求1所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入小粒水稻中。10.—种培育籽粒变长，粒重增加的转基因植物的方法，是过表达目的植物中权利要求1所述基因的表达，得到籽粒变长，粒重增加的转基因植物;所述目的植物为携带权利要求1所述基因的植物。

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