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申请/专利权人：江苏省海洋资源开发研究院(连云港);淮海工学院

摘要：本发明是一种来自海洋的解角质素微杆菌（Microbacteriumkeratanolyticum）MCDA02，其保藏号为：CGMCCNO.13539。该菌株为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，在2216E固体培养上培养48h后：黄色，半透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取。该菌株在5℃及45℃生长缓慢，最适生长温度为30℃。生长的pH适宜范围为6.0‑9.0，最适生长pH为8.0；在NaCl浓度为0%‑10%时可以生长，最适生长的NaCl浓度为3%。本发明还公开了一种利用菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法与产品。本发明的解角质素微杆菌MCDA02菌株所产的几丁质脱乙酰酶的最适pH为8.0，最适温度为30℃，在低温时具有较高活性，在工业应用中可以节约能量和降低成本。

主权项：1.一种来自海洋的解角质素微杆菌（Microbacteriumkeratanolyticum）MCDA02，其特征在于：所述的解角质素微杆菌（Microbacteriumkeratanolyticum）MCDA02的保藏号为：CGMCCNO.13539。

全文数据：来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02及其产酶方法与产品技术领域[0001]本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国黄海海州湾海域海泥的解角质素微杆菌MCDA02Microbacteriumkeratanolyticum;该菌株已经于2017年1月6号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.13539;本发明还涉及该菌株产几丁质脱乙酰酶的方法与产品。背景技术[0002]几丁质又叫甲壳素、甲壳质，为N-乙酰葡糖胺通过β-1，4_糖苷键连接聚合而成的结构同多糖。几丁质广泛存在于无脊椎动物的外骨骼及表皮和真菌及藻类的细胞壁中，是仅次于纤维素居世界第二的天然有机化合物。几丁质不溶于水、酒精、弱酸和弱碱等液体，不容易被广泛的开发利用。壳聚糖是几丁质的N-脱乙酰基形式，因其分子中有大量游离氨基，具有良好的生物相容性和生物可降解，并具有抗癌、降低胆固醇、降血压等生物活性，广泛应用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域。[0003]几丁质脱乙酰转化为壳聚糖的处理方法分为化学热碱法和生物酶法。采用强碱热化学法生产，该法不仅污染严重，且反应过程不易控制，产品分子量不稳定。尤为严重的是排放物造成了巨大的环境污染，对周边生态破坏严重。几丁质脱乙酰酶（Chitindeacetylase,E.C.3.5.1.41可以水解脱掉甲壳素上的乙酰基，条件温和、脱乙酰程度一致、且不造成环境污染，为解决壳聚糖生产中的环境污染问题提供了一条新的途径。另外，将几丁质脱乙酰酶与几丁质酶联用，还可以生产出化学法不能生产的具有特定乙酰化位置的或者分子质量分布范围窄的壳聚糖产品。[0004]酶法制备壳聚糖条件温和、环境友好、产品质量稳定，引起了人们的高度关注。几丁质脱乙酰酶的研究和规模化制备是酶法制备壳聚糖的前提条件。1974年，MucorrouxiiCDA被日本研究者首次报道。随后，研究者已经从真菌、细菌和昆虫分离获得了CDA。其中，微生物最利于低成本规模化制备几丁质脱乙酰酶。目前，产几丁质脱乙酰酶的真菌菌株报道最多。产几丁质脱乙酰酶的细菌只有Alcaligenessp.Srinivasanetal,1998和Rhodococcussp.。相对于真菌，细菌产几丁质脱乙酰酶速率更快。[0005]目前报道的几丁质脱乙酰酶存在产酶活力低、脱乙酰效果差等问题。特别对于我国来讲，在几丁质脱乙酰酶方面的研究起步较晚，相关报道少。因此，需要扩大对产几丁质脱乙酰酶微生物资源的筛选，缓解上述存在的问题，以满足工业化生产需要。目前报道的微生物几丁质脱乙酰酶的最适温度为50_60°C。海洋细菌解角质素微杆菌MCDA02所产CDA最适合作用温度较低，常温下催化活性更高，在工业应用中具有节省能源，降低成本的优势。发明内容[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产几丁质脱乙酰酶的来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02。[0007]本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法与产品。[0008]本发明的特征包括解角质素微杆菌（MicrobacteriumkeratanolyticumMCDA02菌株本身（以下简称菌株MCDA02，以及利用该菌株发酵生产几丁质脱乙酰酶的方法。[0009]本发明涉及的菌株MCDA02是在中国黄海海州湾海域的海泥中分离到的解角质素微杆菌MCDA02Microbacteriumkeratanolyticum，该菌株已经与2017年1月6号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.13539。保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。联系电话为010-64806086。[0010]本发明还公开了利用来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法，其步骤如下：将以上所述的解角质素微杆菌MCDA02接种到种子培养基中，转速180rmin，30°C培养24h，得种子液;将种子液以1%的接种量接种于产酶培养基中，180rmin，20°C培养48h，10000rmin离心10min，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶粗酶液;所述种子培养基为:酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，NaCl1%，陈海水配制，pH7.0;发酵培养基:玉米浆0.5%，可溶性淀粉0.3%，NH4S〇40.3%，KH2P〇40.15%，MgS〇40.05%，粉末几丁质1%，陈海水配制，pH8.0。[0011]本发明还公开了一种几丁质脱乙酰酶，该几丁质脱乙酰酶是以所述的解角质素微杆菌MCDA02为产酶菌，再按照以上所述的产酶方法发酵培养得到几丁质脱乙酰酶粗酶液。[0012]以下对本发明进行详细阐述。[0013]一、本发明菌株MCDA02的形态特征与生理生化特征。[0014]1.1形态特征：该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢参照图1。该菌株在2216E固体培养上培养48h后:黄色，半透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取。在含有胶体几丁质和对硝基-N-乙酰苯胺的筛选培养基上能够产生黄色变色圈（参照图2。[0015]1.2生理生化特征：该菌株淀粉水解、吲哚试验、硫化氢产生、精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，柠檬酸盐利用、接触酶、明胶液化、VP试验、甲基红、葡萄糖发酵、硝酸盐还原试验均为阴性。部分生理生化结果见表1。[0016]表IMCDA02菌株的牛理牛化试骀结果注:+:阳性;阴性；1.3菌株MCDA0216SrDNA序列的扩增和分析用Axygen试剂盒提取得到MCDA02的基因组，选用扩增原核微生物16srDNA序列的通用引物于PCRmix体系中反应。[0017]所述用于PCR反应的通用引物为：27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’所述反应体系为:PCRmix21yL，上下游引物各IyL，DNA模板2yL。反应程序:94°C变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸903,32个循环;72°：终延伸1〇1^11。将?0?产物送至南京思普金公司测序，得1395bp序列。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现与菌株MicrobacteriumkeratanoIyticumOUOl登录号：DQl18082·I16SrDNA相似性达100%。用MEGA7.0软件进行16SrDNA序列的比对分析，并构建系统发育树，菌株MCDA02与MicrobacteriumkeratanolyticumOUOl亲缘关系最近（参见图3二、本发明菌株MCDA02生长特性本发明提供的菌株MCDA02,对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清了不同条件下该菌的生长情况。[0018]2.1本发明涉及的培养基2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，FeP〇40.01%，琼脂2%，陈海水配置，pH7.0〇[0019]筛选培养基：胶体几丁质0.2%，K2HP〇40.07%，KH2P〇40.03%，MgS〇40.05%，对硝基-N-乙酰苯胺0.02%，陈海水配置，pH7.0。[0020]种子培养基:酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，NaCl1%，陈海水配置，pH7。[0021]发酵培养基：玉米浆0.5%，可溶性淀粉0.3%，NH4S〇40.3%，KH2P〇40·15%，MgS〇40.05%，粉末几丁质I%，陈海水配制，pH8.0。[0022]2.2种子液的制备：将菌株MCDA02的2216E斜面种子接种到种子培养基中30°C，180rmin，装液量20%，培养24h。[0023]2.3温度对菌株1«1^02生长的影响将种子液以1%的接种量接于2216E液体培养基中，转速180rmin，装液量为20%，分别在不同温度下培养48h，培养基起始pH7.0,每隔6h取样测定其OD6qq的值。MCDA02最佳生长温度为30°C下生长最快，5°C和45°C菌株生长速度显著降低参见图4。[0024]2·4ρΗ对菌株生长的影响在ρΗ3·0-pHl1·0范围、温度为30°C，其它条件同2·3，对MCDA02进行摇瓶培养，发现该菌在pH6.0-9.0范围内生长良好，最适生长pH为8.0,参见图5。[0025]2.5NaCl浓度对菌株生长的影响用蒸馏水配置2216E培养基，NaCl范围为0%-10%，然后接种该菌在最适温度和pH条件下培养，发现该菌在〇%-10%的NaCl浓度范围内可以生长，最适生长的NaCl浓度为3.0%，参见图6。[0026]三、菌株MCDA02发酵生产几丁质脱乙酰酶的方法发明人对菌株MCDA02发酵生产几丁质脱乙酰酶的方法进行了研究。[0027]3.1发酵时间对菌株MCDA02产酶的影响将种子液以1%接种量接种至发酵培养基，30°C、装液量20%、180rmin发酵60h，每隔6h取样测酶活力，结果表明48h产酶最高参图7。[0028]3.2发酵温度对菌株MCDA02产酶的影响将种子液以1%接种量接种至发酵培养基，装液量20%、180rmin，在不同温度下进行48h培养，结果显示30°C时酶产量达到最高，20°C时有较高的产酶量，达到最高产酶的80%参图8。[0029]3.3培养基起始pH对菌株MCDA02产酶的影响将种子液以1%接种量接种至发酵培养基，30°C、装液量20%、180rmin，调节发酵培养基不同初始pH，培养48h后测定酶活力，结果表明，随着初始pH的升高酶产量逐渐增加，当pH达到8.0时产酶量达到最大，低于pH6.0或高于ρΗΙΟ.Ο时酶产量显著降低参见图9。[0030]3.4装液量对菌株MCDA02产酶的影响将种子液以1%接种量接种至不同装液量发酵培养基，30°C、180rmin，培养48h后测定酶活力，结果显示250mL三角瓶中装液量在20%时产酶最高，（参见图10。[0031]3.5诱导剂对菌株MCDA02产酶的影响将种子液以1%接种量接种至不同几丁质含量的发酵培养基，30°C、装液量20%、180rmin，培养48h后测定酶活力，几丁质添加量为3%时产酶量达到最大值参见图11。[0032]3.6几丁质脱乙酰酶活性测定方法试管中加入30°C预保温的0.05molLpH7.0磷酸缓冲液3mL，200mgL的对硝基乙酰苯胺水溶液lmL，酶液lmL，于30°C水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000rmin离心IOmin，测定上清液的吸光度。以添加ImL同样浓度沸水浴灭活15min的酶液作为对照。酶活单位U定义:在上述反应条件下每小时产生Iyg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。[0033]四、温度和pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响4.1粗酶液的制备将菌株MCDAOl的2216E斜面种子接种到种子培养基中，30°C，180rmin，装液量20%，培养24h，得到种子液。以1%接种量将种子液接种至装液量为20%的发酵培养基，30°C、180rpm摇床培养60h，10000rmin离心lOmin，取上清即为几丁质脱乙酰酶粗酶液。[0034]4.2温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响在pH7.0，0.05mmolL磷酸缓冲液中于不同温度下测定纯化几丁质脱乙酰酶活力，确定酶的最适合作用温度，结果见图12,酶的最适合作用温度是30°C，在15°C和45°C仍保持40%以上相对酶活。[0035]4.3温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响将几丁质脱乙酰酶在PH7.0，0.05molL磷酸缓冲液中分别于不同温度下分别保温Oh-2.5h，然后测定残余酶活力，确定酶温度稳定性，结果见图13，酶在4°C时最稳定，30°C的半衰期为2.Oh。[0036]4.4pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响配制不同pH的0.05molL缓冲液，磷酸缓冲液pH5.0-pH8.0，Tris-HCl缓冲液诚8.0_pH9.0,Gly-NaOH缓冲液pH9.0-pH12.0。在30°C于不同pH的缓冲液下以对硝基乙酰苯胺为底物测定酶的活力，结果见图14,酶的最适pH为8.0，在pH7.0-pHIO.0具有70%以上酶活性。[0037]4.5pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响将酶在不同pH的缓冲液中分别于30°C保温lh，然后在30°C于pH7.0的0.05molL磷酸缓冲液中测定残余酶活力。结果见图15，在pH为8.0时，酶的稳定性最好，酶在pH7.0-pHIO.0具有80%以上相对酶活，在酸性条件下，酶活性显著降低。附图说明[0038]图1为菌株MCDA02的革兰氏染色图（X1000;图2为菌株MCDA02在初筛平板形成的变色圈图；图3为菌株MCDA02系统进化树；图4为温度对菌株MCDA02生长的影响图；#5°C，〇15°C，，_30°C，A45°C图5为pH对菌株MCDA02生长的影响图；图6为NaCl浓度对菌株MCDA02生长的影响图；图7为发酵时间对菌株MCDA02发酵产酶的影响图；图8为温度对菌株MCDA02发酵产酶的影响图；图9为培养基初始pH对菌株MCDA02发酵产酶的影响图；图10为装样量对菌株MCDA02发酵产酶的影响图；图11为粉末几丁质添加量对菌株MCDA02发酵产酶的影响；图12为温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响；图13为温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响；#4°C，〇15°C，°C图14为pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响；赢？!15.〇1!18.0，#?!18.〇-ρΗ9·0，〇ρΗ9·0-ρΗ12·0图15为pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响。赢？!15.〇1!18.0，#?!18.〇-ρΗ9·0，〇ρΗ9·0-ρΗ12·0。具体实施方式[0039]以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。[0040]实施例1，一种来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02MicrobacteriumkeratanolyticumCGMCCNO.13539。该菌株具有以下特征:该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。该菌株在2216E固体培养上培养48h后:黄色，半透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取。在含有胶体几丁质和对硝基-N-乙酰苯胺的筛选培养基上能够产生黄色变色圈。该菌株淀粉水解、吲哚试验、硫化氢产生、精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，柠檬酸盐利用、接触酶、明胶液化、VP试验、甲基红、葡萄糖发酵、硝酸盐还原试验均为阴性。该菌株在低于5°C和高于45°C生长缓慢，最适生长温度为30°C。生长的pH适宜范围为6.0-10.0,最适生长pH为8.0;在NaCl浓度为0%-10%时可以生长，最适生长的NaCl浓度为3%。[0041]实施例2,一种如实施例1所述的解角质素微杆菌MCDA02发酵产生几丁质脱乙酰酶的方法，其步骤如下:将2216E斜面保存的菌株MCDA02接种到种子培养基中，装液量20%、转速180rmin、30°C培养24h，得种子液;将种子液以1%的接种量接种于产酶培养基中，装液量20%、转速180rmin、30°C培养48h，10000rmin离心lOmin，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶。所述种子培养基为:酵母粉O.I%，蛋白胨0.5%，NaClI%，陈海水配制，pH7.0;发酵培养基：玉米浆0.5%，可溶性淀粉0.3%，NH4S〇40.3%，KH2P〇40.15%，MgSk0.05%，粉末几丁质I%，陈海水配制，pH8.0。

权利要求：1.一种来自海洋的解角质素微杆菌MicrofciacteriuffiAerata_noiyi;icimMQA02,其特征在于:所述的解角质素微杆菌Wicr〇bacteri™Aeratan〇iyticurnMCDAO2的保藏号为：CGMCCNO.13539〇2.—种利用来自海洋的解角质素微杆菌MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于，其步骤如下:将权利要求1所述的解角质素微杆菌MCDA02接种到种子培养基中，转速180rmin，30°C培养24h，得种子液;将种子液以1%的接种量接种于产酶培养基中，180rmin，20°C培养48h，10000rmin离心10min，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶粗酶液;所述种子培养基为:酵母粉0.1%，蛋白胨〇.5%，NaCl1%，陈海水配制，pH7.0;发酵培养基：玉米浆0.5%，可溶性淀粉0.3%，NH4SO40.3%，KH2PO40.15%，MgS〇40.05%，粉末几丁质1%，陈海水配制，pH8.0。3.—种几丁质脱乙酰酶，其特征在于:该几丁质脱乙酰酶是以权利要求1所述的解角质素微杆菌MCDA02为产酶菌，再按照权利要求2所述的产酶方法发酵培养得到几丁质脱乙酰酶粗酶液。

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