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申请/专利权人：西南医科大学

摘要：本发明公开的属于糖尿病肾病治疗技术领域，具体为BMSC‑Exo对高糖诱导HK2细胞损伤保护机制的研究方法，该BMSC‑Exo对高糖诱导HK2细胞损伤的保护机制的实验步骤包括HK2细胞的分组与处理、CrisprCas9技术构建miR‑886‑5p敲除的HK2细胞系、RNApulldown技术、FISH实验、DN的建立和PAS糖原染色，通过生物信息学预测结合荧光素酶报告载体实验证明miR‑886‑5p与靶基因相互作用，通过RNApulldown实验和FISH实验进一步证明miR‑886‑5p与靶基因结合的关系，通过Rescue实验证明靶基因能够逆转miR‑886‑5p的功能，确认miR‑886‑5p在HK2细胞中发挥作用的机制。

主权项：1.BMSC-Exo对高糖诱导HK2细胞损伤保护机制的研究方法，其特征在于：该BMSC-Exo对高糖诱导HK2细胞损伤的保护机制的实验步骤如下：步骤一：HK2细胞的分组与处理；A：将HK2细胞分为一般实验组和转染实验组，一般实验组包括正常对照组、高糖组、高渗透压对照组，转染实验组包括正常对照组、高糖组、阴性对照组和干扰组；B:将一般实验组中正常对照组的HK2细胞放入5.5mM葡萄糖培养液中进行培养，将一般实验组中高糖组的HK2细胞放入25mM葡萄糖培养液中进行培养，将一般实验组中高渗透压对照组的HK2细胞放入5.5mM葡萄糖+19.5mMMannitol培养液中进行培养，并收集一般实验组中产生的蛋白质、RNA以及细胞培养上清备用；C:将转染实验组中正常对照组的HK2细胞放入5.5mM葡萄糖培养液中进行培养，将转染实验组中高糖组的HK2细胞放入25mM葡萄糖培养液中进行培养，将转染实验组中阴性对照组的HK2细胞放入100nM的anti-miR-NC+5.5mM葡萄糖培养液中进行培养，将转染实验组中干扰组的HK2细胞放100nM的anti-miR-886-5p+25mM葡萄糖培养液中进行培养，同时利用lipofectin3000试剂盒对转染实验组中的HK2细胞进行转染；步骤二：CrisprCas9技术构建miR-886-5p敲除的HK2细胞系；A:从NCBI数据库中查询pri-miR-886-5p的序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择23-250bp的外显子序列输入软件中，进行特异sgRNA设计，根据输出的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNAOligos；B:将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与Cas9质粒进行连接，转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽后获得含shRNA表达元件的Cas9质粒，错配酶法检测剪切活性，靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配；C:错配酶将识别错配的杂合双链并剪切；D:产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断CassgRNA的活性；步骤三：RNApulldown技术；A:加入50μl链霉亲和素磁珠到1.5ml的EP管，放入磁力架，吸去液体；B:加入50μlpH7.520mMTris重悬磁珠；C:重复步骤三中的A-B，吸去液体；D:加入50μl1×RNACaptureBuffer重悬磁珠，加入50pmolRNA探针到磁珠中，混匀，室温孵育30min；E:加入50μl链霉亲和素磁珠到1.5ml的EP管，吸去液体，加入50μlpH7.520mMTris重悬磁珠，吸去液体，加入100μl1×Protein-RNABindingBuffer到磁珠，混匀，加入100μlMasterMix，混匀，4℃孵育60min，吸去液体，加入100μl1×washbuffer，混匀，将EP管放入磁力架，吸去液体；F:重复步骤三中的A-B；G:加入50μlElutionbuffer，混匀，37℃孵育30min，将EP管放入磁力架，收集液体，-20℃保存；步骤四：FISH实验；A:细胞爬片后，室温固定20分钟，在切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃或室温消化120秒钟；B:0.5MPBS洗3次×5分钟，蒸馏水洗1次；C:每张切片加20μl预杂交液，37℃孵育4小时预杂交，用杂交液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，按每张切片加20μl杂交液，37℃杂交过夜；D:杂交后洗涤，滴加封闭液，37℃孵育30分钟，甩去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃室温120分钟，0.5MPBS洗5分钟×4次；E:取1ulSABC-FITC加原位杂交用PBS100ul，每张切片加50ul37℃30分钟；F:用水溶性封片剂或抗荧光衰减封片剂封片后，荧光显微镜观察，阳性细胞的胞浆或胞核着色呈黄绿色荧光；步骤五：DN的建立；A:适应性饲养SD大鼠一周，造模前禁食不禁水12小时，随机挑选30只SD大鼠准备造模，并将30只SD大鼠分为实验组20只SD大鼠和正常对照组10只SD大鼠；B:临时配制1％STZ溶液，按65mgkg腹腔注射到20只SD大鼠的腹腔内，另外10只大鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液，作为正常对照组；C:STZ溶液腹腔注射72小时后，连续3天检测SD大鼠的随机血糖，当随机血糖均16.7mmolL，24h尿量增加1倍，即1型糖尿病模型造模成功，然后对造模成功的SD大鼠的肾组织以及血液、尿液进行检测，并选取肾病模型建立成功的SD大鼠；步骤六：PAS糖原染色；A:切片脱蜡，依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，然后蒸馏水浸泡2min；B:过碘酸水溶液氧化10min；C:蒸馏水重复洗涤；D:Schiff试剂染30min；E:流水洗10min，显出红色为止；F:苏木精复染5min水洗；G:95％乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察并照相；H:PAS染色结果判定：细胞核呈蓝色，肾小球系膜基质、淀粉样物质、纤维蛋白均呈紫红色；I:计算系膜增生面积：Image-ProPlus软件计算各组每只大鼠的紫红色的系膜基质增生区域面积。

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