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申请/专利权人：自然资源部第一海洋研究所;青岛大学;青岛科技大学;中国大洋矿产资源研究开发协会(中国大洋事务管理局)

摘要：本发明提供一种受磷酸化小DNA引导的具有核酸内切酶活性的核酸酶，本发明的具有PIWI结构域的核酸酶发挥的具体作用是对RNA进行剪切。尽管来自嗜热菌PIWI能对DNA双链进行剪切，但需要大于65℃才能发挥作用。本发明发现的PIWI能够在37℃的温和条件下对DNA双链进行剪切，从而更方便进行基因工程操作。

主权项：1.氨基酸序列为SEQIDNO:1、具有PIWI结构域的核酸酶在受磷酸化的小DNARNA引导下作为核酸内切酶来剪切核酸的应用；所述的小DNARNA是长度为10-40bp，与剪切目标DNA链匹配的单链片段或双链片段。

全文数据：受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的PIWI蛋白技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种受磷酸化核苷酸片段DNARNA引导具有核酸内切酶活性的PIWI蛋白。背景技术PIWI结构域是Argonaute蛋白的组成部分，通常位于Argonaute蛋白的C末端。PIWI家族包含一个保守结构，由位于中间的PAZ结构域和位于C末端的PIWI结构域组成。PIWI结构域有一个的类似RNaseH的折叠结构，包含具有催化活性的四聚体Asp-Glu-Asp-XX代表Asp，或Asn，或His。Ago蛋白与核苷酸的作用主要依赖PIWI上的氨基酸残基与发挥引导作用的DNARNA的磷酸二酯碱结合，对目标链进行剪切。在有些Argonaute蛋白中，PIWI中具有剪切活性的氨基酸发生突变，导致Argonaute蛋白内切核酸酶活性缺失。目前所报道的PIWI结构域基本只作用于RNA，作用于DNA的报道仅有来自嗜热菌的Argonaute蛋白，在75℃作用下才能对DNA发生剪切作用。而本发明所提供的PIWI结构域，在37℃能够对DNA发生剪切作用，且受到磷酸化小DNA的引导能够进行定点切割，从而能够应用于基因的定点编辑。依据PIWI的核酸内切酶功能，该酶可能参与了细菌的免疫防御。特别是PIWI的N端含有一个RecJ的结构域，该结构域主要参与基因组的重组和修复。而PIWI和RecJ偶联在一起，可能保护染色体免受外源物质的破坏，执行了保护染色体免受伤害，是细菌免疫的最后一道防线。发明内容本发明的一个目的是提供一种磷酸化短核苷酸片段DNARNA引导，且具有核酸内切酶活性的核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用，应用于基因的编辑本发明提供的是一种细菌的PIWI结构域的核酸酶，能够结合不同的磷酸化的小DNARNA,对多个特定位点发挥核酸内切酶作用，进行基因编辑本发明首先提供一种具有PIWI结构域的核酸酶，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；MKQLAPFGVSNPTPKIMLQQANIGEMKKIGSEANHLKIQFKQNGSSLDGIGFHFGYVYEQMSVQDRVSAVGTLSINEWNGHIKPQLMIEDIAVTDWQLFDWRSVQKLRLEDKLKLISLPTQYLIAFNDETKVKLKLENEQIWTREQLSHIDSFENAAVVLLDLPASEQEIKQLFADKGRPSQIFCLFYQEEDSFFSASPNRETFKWFYAFLRKQKKFNLNEQGMKLISYKGWSKESVKFMVEVFVELNFIRQENGWLIIEENPEKKSLTDSVAFQRKENQRTLENDFVYSSFEHLKQLFTTIFEQNTNESTIKETV；由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，只要该多片段或多肽变体与前述氨基酸具有相似或相同的活性位点，均属于本发明保护范围之列本发明的具有PIWI结构域的核酸酶，在受磷酸化的小DNARNA引导下能作为核酸内切酶来使用，所述核酸为超螺旋DNA，线性双链DNA，线性单链DNA，环状单链DNA中的任一种，所述小DNARNA，其长度为10-40bp，所述的小DNARNA可以是与剪切目标DNA链匹配的单链片段或双链片段；本发明还提供上述氨基酸序列为SEQIDNO:1的核酸酶的制备方法，包括如下的步骤：1构建定点切割核酸酶的重组表达质粒PCR扩增编码PIWI结构域的片段，获得编码PIWI结构域的基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建PIWI结构域重组表达质粒；2重组表达PIWI蛋白将构建的PIWI重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21DE3，得到PIWI蛋白重组表达菌株，再将其用诱导剂IPTG进行诱导表达；3亲和纯化表达的PIWI蛋白离心收集诱导表达PIWI的大肠杆菌，将菌体用非变性蛋白裂解液重悬，超声破碎菌体，离心收集含有PIWI蛋白的大肠杆菌裂解液上清，利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化PIWI蛋白。4检测PIWI蛋白的内切活性，测定不同温度对PIWI蛋白剪切效率的影响；5检测5’磷酸化DNA片段对PIWI蛋白的引导作用，测定特异的磷酸化片段对特定位点的剪切。不同长度磷酸化片段引导下对DNA双链剪切的效率。其中步骤2中所用IPTG诱导培养条件为：先将PIWI重组表达菌株在37℃培养至OD＝0.8-1.0，培养箱内使培养基冷却至16℃，再加入IPTG至终浓度为0.4mM,在16℃过夜诱导培养。步骤3中，所属非变性蛋白裂解液的组成如下：20mMpH值为8.0的Tris-HCL，200mMNaCL,0.5mMDTT，1％甘油。步骤4中，所述DNA底物为表达PIWI所用质粒相关质粒或与所表达质粒没有任何同源序列的质粒不相关质粒。步骤5中，所述短核苷酸片段DNARNA从10-40bp核苷酸长度，加入的磷酸化小DNA包括与底物匹配的磷酸化小DNA，与底物匹配的两条互补的磷酸化小DNA；与底物不匹配的磷酸化小DNA。目前报道的PIWI类核酸酶主要在RNA干扰过程中发挥作用，PIWI发挥的具体作用是对RNA进行剪切。尽管来自嗜热菌PIWI能对DNA双链进行剪切，但需要大于65℃才能发挥作用。本发明发现的PIWI能够在37℃的温和条件下对DNA双链进行剪切，从而更方便进行基因工程操作。附图说明图1：嗜碱芽孢杆菌BacillusalcalophilusPIWI蛋白纯化电泳图，其中1:蛋白marker、2：纯化的PIWI蛋白；图2：PIWI蛋白对相关质粒的作用图，其中1：PIWI蛋白；2：对照蛋白；3：没添加蛋白；4：没经过处理的质粒；底物为pET28-PIWI质粒，该质粒为表达PIWI所用的质粒图3：温度对PIWI活性的影响图，其中1-5分别代表PIWI蛋白在23℃，30℃，37℃，44℃，50℃下对质粒的剪切作用。所用质粒为PET28-PIWI，蛋白与质粒的摩尔比为10:1；图4：PIWI蛋白结合的核苷酸类型分析图，其中1：PIWI纯化蛋白经蛋白酶K处理；2：PIWI纯化蛋白经蛋白酶K处理加入RNA酶；3：PIWI纯化蛋白经蛋白酶K处理加入DNA酶处理；图5：特定磷酸化片段引导下的定点切割图，其中1：加入的PIWI分别结合了互补的单链5’磷酸化的小DNA；2:未加入小DNA；3：对照质粒。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述。实施列1：PIWI原核表达载体的构建1.1载体构建：根据GenBank公布的嗜碱芽孢杆菌Bacillusalcalophilus的RecJ基因序列针对PIWI设计以下引物对，其中上游引物pET28PIWIF:5'ATGGAAGGGTTAAGTGCTCT3'，上游引物pET28PIWIR:5'TACCGTCTCCTTGATTGTAC3'。用NdeI和BamHI对载体pET-28a+进行双酶切，通过无缝克隆将PIWI插入相应位点，构建表达载体pET28a-PIWI。引物设计合和质粒测序均由上海生物工程技术有限公司引物合成。最终获得的PIWI酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。1.2体外诱导表达重组表达载体pET28a-PIWI转化BL21DE3宿主，挑选单菌落接种于3ml含卡那霉素50μgml的LB液体培养基，37℃过夜培养。取部分过夜培养物，加入无菌甘油至终浓度为10％，混匀后于-70℃保存。剩余菌液作为诱导表达的母液，接种于含卡那霉素50μgml的LB液体培养基，37℃培养，待OD600达到0.6～0.8时，在16℃培养箱内预冷培养基2-3h，使培养基预冷到16℃，然后加入适量IPTG终浓度0.5mM，于16℃，过夜培养。1.3诱导产物的纯化将过夜诱导的菌液收集于50ml离心管，5000g，4℃离心25min收获菌体。用columnbuffer重悬菌体，并用漩涡振荡器连续振荡15min，菌体破碎仪中漩涡破碎，13000g离心10min后，取上清进行目的蛋白纯化图1。将菌体裂解液用BindingBuffer稀释后负载上柱，使用15倍柱体积的BindingBuffer冲洗柱子，去除杂蛋白；使用ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰ElutionBuffer：20mMTris-HClPH7.9200～500mM咪唑0.5MNaCl，将流出液收集后备用；洗脱后，使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡乙醇要将填料浸没，4℃保存；将梯度洗脱后的流出液用Millipore超滤管15ml10KD于5000g水平转子超滤40min，对目的蛋白浓缩后-80℃备用。实施例2：PIWI蛋白对相关质粒的剪切1.PET28PIWI质粒提取质粒提取采用生工生物工程有限公司柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行，提取PET28PIWI和pUC57的质粒，此两个质粒有同源区域约800bp。提取的质粒通过琼脂糖凝胶电泳分析其质量并进行定量。2.PIWI核酸酶对相关质粒的剪切相关质粒转入宿主细胞后会产生大量与质粒本身互补的小DNARNA片段，表达的PIWI蛋白能够结合这些小DNARNA片段，对质粒本身产生剪切作用。将PIWI蛋白与质粒表达该蛋白的质粒PET28-PIWI按照10:1的摩尔比进行混合，37℃作用4h，分析剪切效率。当酶与质粒的摩尔比为10:1时，PIWI蛋白能将相关质粒的超螺旋完全剪切成开环或线性，而对照蛋白没有剪切作用图2。将PIWI蛋白与质粒的混合液置于不同的温度下进行反应，分析温度对剪切效率的影响。PIWI蛋白在37℃时活性最高，23℃时基本没有活性图3。实施例3：PIWI结合的短核苷酸片段的分析及5’磷酸化DNA片段对PIWI核酸酶定向剪切的引导作用1、PIWI结合的短核苷酸片段的类型分析将PIWI用蛋白酶K进行处理，55℃2h，将PIWI彻底降解；用酚氯仿抽提上述降解产物，纯化与PIWI结合的小核苷酸片段；分别用RNA酶或DNA酶对小核苷酸片段进行处理，确定PIWI结合的是DNA还是RNA。结果显示：加入RNA酶的样品电泳没有出现小核苷酸片段，而加入DNA酶的样品电泳显示有小核苷酸片段，说明PIWI在体内结合的是小RNA图4。2、5’磷酸化DNA片段的设计依据pEGFP质粒的序列，设计能够和某一段结合的5’磷酸化DNA片段pEGFP-1：5-ACGAGTTTTCGCTACTTGTT-3；完全互补的序列pEGFP-2：AACAAGTAGCGAAAACTCGT；间隔10个碱基互补的序列pEGFP-3：ATAATTACCTTATCAAAAAC；没有互补关系的序列：pNC:CTGCTGACGGTGATTTCTGG3、PIWI结合的小核苷酸片段的降解及特异性5’磷酸化DNA片段的结合在PIWI中加入RNA酶，在37℃作用10min，降解PIWI结合的小RNA；将与目标质粒互补的小DNA加入到含有被RNA处理过的PIWI蛋白，37℃作用1h，使小DNA与PIWI完全结合。将结合了5’磷酸化DNA片段的PIWI与pEGFP与表达PIWI的PET28没有同源区域按照31：1的摩尔比混合，在37℃条件下作用4h，电泳分析对质粒剪切的影响。结果显示：将PIWI结合的小RNA降解后，PIWI可以和磷酸化的小DNA片段结合，并且分别结合了互补的单链5’磷酸化的小DNA的PIWI可以将超螺旋质粒剪切成线性片段，而没有结合小DNA的PIWI没有剪切作用图5。上述结果表明本发明的PIWI酶能够在37℃的温和条件下对DNA双链进行剪切。序列表自然资源部第一海洋研究所青岛大学受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的PIWI蛋白1SIPOSequenceListing1.01316PRT人工序列ArtificialSequence1MetLysGlnLeuAlaProPheGlyValSerAsnProThrProLysIle151015MetLeuGlnGlnAlaAsnIleGlyGluMetLysLysIleGlySerGlu202530AlaAsnHisLeuLysIleGlnPheLysGlnAsnGlySerSerLeuAsp354045GlyIleGlyPheHisPheGlyTyrValTyrGluGlnMetSerValGln505560AspArgValSerAlaValGlyThrLeuSerIleAsnGluTrpAsnGly65707580HisIleLysProGlnLeuMetIleGluAspIleAlaValThrAspTrp859095GlnLeuPheAspTrpArgSerValGlnLysLeuArgLeuGluAspLys100105110LeuLysLeuIleSerLeuProThrGlnTyrLeuIleAlaPheAsnAsp115120125GluThrLysValLysLeuLysLeuGluAsnGluGlnIleTrpThrArg130135140GluGlnLeuSerHisIleAspSerPheGluAsnAlaAlaValValLeu145150155160LeuAspLeuProAlaSerGluGlnGluIleLysGlnLeuPheAlaAsp165170175LysGlyArgProSerGlnIlePheCysLeuPheTyrGlnGluGluAsp180185190SerPhePheSerAlaSerProAsnArgGluThrPheLysTrpPheTyr195200205AlaPheLeuArgLysGlnLysLysPheAsnLeuAsnGluGlnGlyMet210215220LysLeuIleSerTyrLysGlyTrpSerLysGluSerValLysPheMet225230235240ValGluValPheValGluLeuAsnPheIleArgGlnGluAsnGlyTrp245250255LeuIleIleGluGluAsnProGluLysLysSerLeuThrAspSerVal260265270AlaPheGlnArgLysGluAsnGlnArgThrLeuGluAsnAspPheVal275280285TyrSerSerPheGluHisLeuLysGlnLeuPheThrThrIlePheGlu290295300GlnAsnThrAsnGluSerThrIleLysGluThrVal305310315

权利要求：1.一种具有PIWI结构域的核酸酶，其特征在于，所述的核酸酶包含有：1氨基酸序列为SEQIDNO:1的核酸酶2任何含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，其具有与1中核酸酶相似或相同的活性。2.权利要求1所述的具有PIWI结构域的核酸酶在受磷酸化的小DNARNA引导下作为核酸内切酶剪切核酸的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的核酸为超螺旋DNA，线性双链DNA，线性单链DNA，环状单链DNA中的任一种。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小DNARNA，其长度为10-40bp。5.如权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述的小DNARNA是与剪切目标DNA链匹配的单链片段或双链片段。6.权利要求1所述的具有PIWI结构域的核酸酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：1构建定点切割核酸酶的重组表达质粒PCR扩增编码PIWI结构域的片段，获得编码PIWI结构域的基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建PIWI结构域重组表达质粒；2重组表达PIWI蛋白将构建的PIWI重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21DE3，得到PIWI蛋白重组表达菌株，再将其用诱导剂IPTG进行诱导表达；3亲和纯化表达的PIWI蛋白离心收集诱导表达PIWI的大肠杆菌，将菌体用非变性蛋白裂解液重悬，再超声破碎菌体，离心收集含有PIWI蛋白的大肠杆菌裂解液上清，利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化PIWI蛋白；4检测PIWI蛋白的内切活性，测定不同温度对PIWI蛋白剪切效率的影响5检测5’磷酸化DNA片段对PIWI蛋白的引导作用，测定特异的磷酸化片段对特定位点的剪切，不同长度磷酸化片段引导下对DNA双链剪切的效率。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤2中所用IPTG诱导培养条件为：先将PIWI重组表达菌株在37℃培养至OD＝0.8-1.0，培养箱内使培养基冷却至16℃，再加入IPTG至终浓度为0.4mM,在16℃过夜诱导培养。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤3中，所属非变性蛋白裂解液的组成如下：20mMpH值为8.0的Tris-HCL，200mMNaCL,0.5mMDTT，1％甘油。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤4中，所述DNA底物为表达PIWI所用质粒或与所表达质粒没有任何同源序列的质粒。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤5中，所述短核苷酸片段从10-40bp核苷酸长度，加入的磷酸化小DNA包括与底物匹配的磷酸化小DNA，与底物匹配的两条互补的磷酸化小DNA；与底物不匹配的磷酸化小DNA。

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