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申请/专利权人：广州白云山和记黄埔中药有限公司

摘要：本发明公开了一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S‑告衣春含量的方法，采用高效液相法，色谱条件为：固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，波长230‑235nm；柱温25‑35℃；流动相以甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0‑3min，97％B；3‑25min，97‑90％B；25‑27min，90‑76％B；27‑50min，76％B；流速0.7‑1.0ml·min‑1，本发明能同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和表告依春含量，干扰少、灵敏度高、简便可行、准确快捷、重复性好、稳定性好，可用于板蓝根制剂的质量控制指标。

主权项：1.一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，采用高效液相法，色谱条件为：固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，波长230-235nm；柱温25-35℃；流动相以甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0-3min，97％B；3-25min，97-90％B；25-27min，90-76％B；27-50min，76％B；流速0.7-1.0ml·min-1。

全文数据：一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法技术领域：本发明涉及中药领域，具体涉及一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法。背景技术：中药因其独特的疗效，在防病治病、养生调理、强身健体等方面越来越受人民的青睐。随着政府、企业和科研单位对中药标准规范化的要求逐渐提高，中药材和成方制剂的质量标准研究成为关注的热点，中药材及其制剂质量标准由过去的定性鉴别为主，发展到着重测定其中的单个有效成分的定量控制标准，再到同时测定多成分、多靶点的整体质量评价方法。各种新型分析仪器的应用也使得中药质量标准朝着可控制、稳定化、全面化的方向发展，对实现中药现代化和国际化起着举足轻重的作用。其中，采用高效液相色谱法，建立中药多成分含量同时测定已成为一种趋势。板蓝根颗粒是清热解毒类常用中成药，具有凉血利咽的功效，用于肺胃热盛所致的咽喉肿痛、口咽干燥；急性扁桃体炎见上述证候者，对流感有显著的预防作用。生物碱类化合物表告衣春已被认可为板蓝根药材中主要抗病毒活性成分，在药材和制剂中是以对映异构体的形式存在，即R,S-告衣春，其含量约占生药量的0.05％[参见文献王瑞,杨海英,杨琪伟,黄山君,王峥涛.板蓝根的质量标准研究[J].中草药,2010,4103:478-480.]。木质素类成分亦是板蓝根发挥抗病毒活性的重要物质基础，其中含量最高的是直铁线莲宁B，占生药量的0.04％参见何立巍，董伟，杨婧妍，李祥，李伟.板蓝根抗病毒有效部位的化学成分及其活性研究[J].2008.1239:1895-1897,2008。R,S-告衣春和直铁线莲宁B分别属于不同类别的化合物，是板蓝根中生物碱类和木质素类成分的代表性化合物，但两者的溶解度极性和紫外吸收特征的差异较大，目前未见报道可以同时测定板蓝根制剂中R,S-告衣春和直铁线莲宁B含量的方法。发明内容：本发明的目的是提供一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，该方法干扰少、灵敏度高、简便可行、准确快捷、重复性好、稳定性好，可用于板蓝根制剂的质量控制指标。本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，该方法采用高效液相法，色谱条件为：固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，波长230-235nm；柱温25-35℃；流动相以甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0-3min，97％B；3-25min，97-90％B；25-27min，90-76％B；27-50min，76％B；流速0.7-1.0ml·min-1。其中柱温优选为30℃,紫外检测器波长优选为230nm,流速优选为0.8ml·min-1。其中供试品溶液的制备包括以下步骤：取板蓝根制剂研磨成细粉，加入甲醇，超声提取，再用相同浓度的甲醇补足丢失重量后，过滤，滤液过0.2-0.5μm微孔滤膜，即得供试品溶液；板蓝根制剂与甲醇的质量体积比优选为0.1-1gml，甲醇质量浓度为5wt％-50wt％，加上经济环保的考虑,优选为5wt％。所述板蓝根制剂包括板蓝根颗粒剂、片剂、胶囊。其中对照品溶液的制备包括以下步骤：取直铁线莲宁B对照品，加甲醇制成直铁线莲宁B浓度为20-50μgml的直铁线莲宁B对照品溶液；取R,S-告衣春对照品加甲醇制成R,S-告衣春浓度为10-30μgml的R,S-告衣春对照品溶液。其中直铁线莲宁B浓度优选为25-35μgml；R,S-告衣春浓度优选为20-30μgml。本发明的有益效果如下：1选择230-235nm为测定波长，保证R,S-告衣春和直铁线莲宁B在此波长下均有较强吸收，且色谱图的基线稳定，干扰较小；选择流动相甲醇-水梯度洗脱，保证两个化合物峰均有良好的分离效果。2本发明能同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和表告依春含量，干扰少、灵敏度高、简便可行、准确快捷、重复性好、稳定性好，可用于板蓝根制剂的质量控制指标。附图说明：图1是R,S-告衣春的紫外波长扫描光谱图；图2是直铁线莲宁B的紫外波长扫描光谱图；图3是实施例1供试品和对照品的色谱图；图4是对比例1供试品和对照品的色谱图；图5是对比例2供试品和对照品的色谱图。具体实施方式：以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：同时测定板蓝根颗粒中直铁线莲宁B和R,S-告衣春成分含量的方法1供试品溶液的制备：取板蓝根颗粒研磨，取1g加入5wt％甲醇10mL，超声提取5min，再用相同浓度的甲醇补足丢失重量后，过滤，取滤液25ml过0.45μm或0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；溶剂的选择：已有技术中对R,S-告依春的含量测定方法，其样品处理采用的是水提参见专利201810354557.3或者是5wt％甲醇参见2018年3月国家药典委员会发布了《关于“板蓝根颗粒”标准修订的公示》中对R,S-告依春的含量测定方法提取，该成分本身属于极性偏大的化合物；现有技术参见文献陈勇,李祥,陈建伟,王莹莹.HPLC法测定板蓝根颗粒中直铁线莲宁B和异落叶松脂素的含量[J].现代中药研究与实践.2009.622:53-56对直铁线莲宁B的含量测定方法中，样品处理采用的是50wt％甲醇提取，该成分本身属于中等极性化合物；依据“相似相溶”的原理，极性相差较大的化合物其提取条件也不同。发明人在样品前处理条件筛选试验中，偶然发现对于板蓝根制剂，用水或5％-50％甲醇处理后的提取液中，直铁线莲宁B和R,S告依春都可以检测到，且结果无明显差异。说明，这两个极性相差较大的化合物，可以用同一种溶剂提取出，经试验验证，水提取液不容易过微孔滤膜，加上经济环保的考虑，选择5wt％甲醇为最优。2对照品溶液的制备：取直铁线莲宁B对照品，加50wt％甲醇制成直铁线莲宁B浓度为31.8μgml的溶液。取R,S-告衣春对照品加5wt％甲醇制成R,S-告衣春浓度为23.9μgml的溶液。3检测波长的选择：用二极管阵列检测器分别对R,S-告衣春和直铁线莲宁B对照品溶液在190～400nm进行紫外波长扫描，结果显示R,S-告衣春在192nm和240nm处有较强吸收在240nm处吸收最大见图1，直铁线莲宁B在198.0nm、224.0nm和276.0nm处有较强的吸收，在224.0nm和276.0nm处吸收更大见图2，通过观察两者的紫外吸收图，可知在224nm和276nm及其两者附近，R,S-告衣春几乎无紫外吸收，而在240nm及其附近，直铁线莲宁B几乎无紫外吸收。因此，很容易得出结论：直铁线莲宁B和R,S告依春无法在同一波长下同时得到较大的紫外吸收。发明人在扫描波长试验中偶然发现，在230-235nm范围内，直铁线莲宁B和R,S-告依春都有较大的紫外吸收，可以实现同波长下同时测定。结合两者最大吸收的特点，为保证两个化合物在统一波长下均有较大吸收，本实验选择230-235nm作为测定波长。4分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定分别得到色谱图如图3所示，供试品中的标峰对照品色谱峰保留时间一致。色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，波长230nm；柱温30℃，以甲醇为流动相A，水为流动相B，甲醇与水总体积分数为100％，流速0.8ml·min-1，按表1所示方式进行梯度洗脱：表1时间分钟流动相A％流动相B％0～33973-253～1097～9025～2710～2490～7627～5024765在上述色谱条件下，按R,S-告衣春计算，理论塔板数大于10000，按直铁线莲宁B的色谱峰计算，理论塔板数大于5000，按照外标一点法计算含量。对比例1：采用2018年3月国家药典委员会发布了《关于“板蓝根颗粒”标准修订的公示》，板蓝根颗粒含量测定如下：供试品溶液的制备：取板蓝根颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5wt％甲醇10ml密塞，称定重量，超声处理5min，放冷，再称定重量，用5wt％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表2进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速为0.8mlmin；柱温为30℃。分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定，理论板数按尿苷峰计算应不低于10000。表2时间分钟流动相A％流动相B％0～33973-203～1097～9020～4010～7090～3040～50703050～60397供试品和对照品的色谱图如图4。254nm为检测波长，供试品色谱图中可见R,S-告衣春的目标峰，但未见直铁线莲宁B的目标峰，且直铁线莲宁B对照品的吸收值很小，且此方法的梯度洗脱条件不能有效地分离直铁线莲宁B。对比例2：参考文献陈勇,李祥,陈建伟,王莹莹.HPLC法测定板蓝根颗粒中直铁线莲宁B和异落叶松脂素的含量[J].现代中药研究与实践.2009.622:53-56公布的方法供试品溶液的制备：取适量板蓝根颗粒，研细，精密称取1.0000g,置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取20min45Hz,600W，离心5000rmin10min，取上清液于85℃水浴浓缩，并定容至2mL，过0.45μm微孔滤膜后，即得。色谱条件：色谱柱为AiglengtTC-C18柱4.6mm×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相：水A-甲醇B，梯度洗脱：0～35min22％B，35～36min22％B～30％B，36～60min30％B；体积流量：0.8mLmin；检测波长：280nm，参比波长360nm；进样量：5μL。供试品和对照品的色谱图如图5。选取280nm为检测波长，供试品色谱图中可见直铁线莲宁B的目标峰，但未见R,S-告衣春的目标峰，且R,S-告衣春对照品图中显示，在该波长下R,S-告衣春无吸收。实施例1与对比例1、2比较可知，对比例1、2公开的以上两种方法均不能同时测定板蓝根颗粒中R,S-告衣春和直铁线莲宁B的含量。而本发明选取230-235nm为检测波长，在此方法梯度洗脱条件下，对照品和供试品色谱图中均清晰可见R,S-告衣春和直铁线莲宁B的目标峰，与对比例1、2公开的现有方法比较，供试品中的R,S-告衣春和直铁线莲宁B都有良好的分离度，且峰形良好，周围的干扰峰较少。本方法可实现同时测定板蓝根颗粒中R,S-告衣春和直铁线莲宁B的含量。实施例3：方法学验证：1稳定性试验按照实施例1取板蓝根颗粒供试品溶液1份，分别于0、2、4、8、12、24h进样，测定色谱峰，记录峰面积。结果显示，R,S-告衣春峰面积为1.67％，直铁线莲宁B峰面积RSD为1.50％，说明板蓝根颗粒供试品溶液中直铁线莲宁B和R,S-告衣春24h内稳定性良好结果见表3。表32重复性试验参考实施例1，取平行制备同一批次的板蓝根颗粒供试品溶液6份，依次进样，按高效液相色谱测定色谱条件测定，记录峰面积，R,S-告衣春和直铁线莲宁B的峰面积的RSD分别为0.94％和1.54％，说明方法重复性良好结果见表4。表43加样回收率试验取6份已知含量R,S-告衣春0.0209mgg；直铁线莲宁B0.0256mgg的板蓝根颗粒适量，分别加入R,S-告衣春和直铁线莲宁B对照品后，制备供试品溶液。按实施例1高效液相色谱测定色谱条件，测定色谱峰，记录峰面积，用外标一点法计算测得量。经计算得R,S-告衣春的平均回收率为100.96％，RSD为1.58％，直铁线莲宁B的平均回收率为99.39％，RSD为1.20％，结果表明准确度良好结果见表5。注：该含量测定试验所用的直铁线莲宁B对照品溶液浓度为0.0422mgml。表5

权利要求：1.一种同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，采用高效液相法，色谱条件为：固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，波长230-235nm；柱温25-35℃；流动相以甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0-3min，97％B；3-25min，97-90％B；25-27min，90-76％B；27-50min，76％B；流速0.7-1.0ml·min-1。2.根据权利要求1所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，紫外检测器波长为230nm,流速为0.8ml·min-1。3.根据权利要求1或2所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，柱温为30℃。4.根据权利要求1或2所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，供试品溶液的制备包括以下步骤：取板蓝根制剂研磨成细粉，加入甲醇，超声提取，再用相同浓度的甲醇补足丢失重量后，过滤，滤液过0.2-0.5μm微孔滤膜，即得供试品溶液。5.根据权利要求4所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，板蓝根制剂与甲醇的质量体积比为0.1-1gml，甲醇质量浓度为5wt％-50wt％。6.根据权利要求4所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，甲醇质量浓度为5wt％。7.根据权利要求4所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，所述板蓝根制剂包括板蓝根颗粒剂、片剂、胶囊。8.根据权利要求1或2所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，对照品溶液的制备包括以下步骤：取直铁线莲宁B对照品，加甲醇制成直铁线莲宁B浓度为20-50μgml的直铁线莲宁B对照品溶液；取R,S-告衣春对照品加甲醇制成R,S-告衣春浓度为10-30μgml的R,S-告衣春对照品溶液。9.根据权利要求8所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，直铁线莲宁B浓度为25-35μgml。10.根据权利要求8所述同时测定板蓝根制剂中直铁线莲宁B和R,S-告衣春含量的方法，其特征在于，R,S-告衣春浓度为20-30μgml。

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