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申请/专利权人：山东省寄生虫病防治研究所

摘要：本发明公开了一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法及应用，成年蚊子的中肠被分离并在PBS中涡旋粉碎，以将肠道菌群完全释放到缓冲液中，在30℃下，在LB培养基上，连续稀释10μL匀浆，培养过夜，通过显微观察，在LB培养基上描绘了在菌落形态，透明度，大小，光泽和颜色上有明显差异的细菌，总共获得了13个菌株，13个菌株的全长16SrRNA均被扩增，测序数据在生物信息中心上传收录号GCA_001976145.1，并确定了S.oryzae菌落，本发明从白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae，并验证了其在体内和体外增强杀虫剂抗性的作用，S.oryzae可被商业用于分解农田和湖泊中残留的杀虫剂，以保护环境。

主权项：1.一种白纹伊蚊中分离出肠道共生菌S.oryzae的方法，包括以下步骤：S1：选择白纹伊蚊敏感菌株，白纹伊蚊敏感菌株已在研究所养蚊室培育了超过20年的时间，没有接触过任何种类的杀虫剂，使用杀伤浓度为50％的溴氰菊酯对每一代幼虫阶段处理，筛选出抗杀虫剂菌株，并将筛选后的存活者用于繁殖下一代；S2：超过3年时间的筛选，与敏感蚊子相比，其抗性比为109.6，第52代蚊子被认为是耐药菌株，捕获于田间蚊虫，并在实验室中稳定饲养，用猪肝粉和酵母粉的混合物喂养幼虫；将成年蚊子转移到蚊子笼中，用10％葡萄糖溶液喂养，并通过Hemotek装置喂饲羊血；测试幼虫杀虫剂耐药性的生物测定是按照世界卫生组织指南进行的：耐药性比RR＝耐药菌株LC50敏感菌株LC50；每种菌株的溴氰菊酯LC50列在Table1中，以显示其抵抗和易感状态与折叠变化，成蚊的生物测定使用0.03％的溴氰菊酯药膜接触筒法进行；S3：用75％酒精消毒成年蚊子的表面3分钟，然后用无菌的1×PBS缓冲液冲洗2分钟，对于每个菌株，设置了五个生物重复组，通过超声粉碎肠道样本组织，按照DNA分离试剂盒的说明提取总DNA，用引物27F1492R扩增16SrRNA基因的全长，将PCR反应置于10μL反应体系中，对PCR产物进行纯化、定量和均质化，以创建测序文库SMRTBell，在质量检查之后，使用单分子测序仪PacBioSequel进行文库测序，QIIME软件中的UCLUST用于以97％的相似度对标签进行聚类，并获得了OTU操作分类单元；S4：对白蚊伊蚊不同菌株的肠道共生菌进行了三个不同方面的鉴别筛选，实验室耐药蚊子和易感毒株蚊子为一组，野外捕获的耐药蚊子为一组，捕获的易感蚊子以及氨氯菊酯处理前后的蚊子一组，进行了比较；以LC50浓度为38.03μgL的溴氰菊酯对野外捕获的耐药蚊子的幼虫进行处理，观察杀虫剂选择压力下共生菌组成和多样性的变化，超过200只正常活跃的幼虫用溴氰菊酯处理，而对照组则常规喂养，24h后，从两组选择正常活性的幼虫作为试验样品，每组有5个生物重复，16SrRNA的提取，实验室耐药蚊子和敏感株蚊子的测序和分析以及捕获的敏感蚊子以及溴氰菊酯处理前后的蚊子的测序和分析均同上进行；S5：成年蚊子的中肠被分离并在PBS中涡旋粉碎，以将肠道菌群完全释放到缓冲液中，在30℃下，在LB培养基上，连续稀释10μL匀浆，培养过夜，通过宏观观察，在LB培养基上描绘了在菌落形态，透明度，大小，光泽和颜色上有明显差异的细菌，总共获得了13个菌株，13个菌株的全长16SrRNA均被扩增，测序数据在生物信息中心中收录号GCA_001976145.1，并确定了S.oryzae菌落，用革兰氏和荚膜孢子染色对分离的菌落进行染色，并使用浸油显微镜检查形态学特征。

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