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南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法 

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申请/专利权人:云南大学

摘要:本发明公开了南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法,涉及分子微生物学技术领域,其技术要点为:包括以下步骤:S1、寡孢节丛孢Arthrobotrysoligospora的培养;S2、寡孢节丛孢细胞外囊泡的获得及表征分析;S3、捕食线虫真菌寡孢节丛孢细胞外囊泡的荧光标记;S4、南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡。本发明首次报道了南方根结线虫可吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡,这对于理解食线虫真菌与线虫互作机制具有重要意义,同时在线虫生物防治领域也展现出了潜在的应用价值。

主权项:1.南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法,其特征是:包括以下步骤:S1、寡孢节丛孢Arthrobotrysoligospora的培养:Step1:寡孢节丛孢的复壮采用TYGA固体培养基复壮菌种库中的寡孢节丛孢,PDA固体培养基正常培养复壮后的寡孢节丛孢;Step2:寡孢节丛孢的培养将步骤Step1中复壮后的TYGA菌块接种于6cm的固体PDA平板于28℃培养5天;S2、寡孢节丛孢细胞外囊泡的获得及表征分析:将PDA菌块接种于TG液体培养基于28℃静置培养4天后,于28℃,180rpm摇床培养48小时,过滤菌丝收集上清液;将上清液通过梯度离心后采用0.22μm的滤头过滤,对获得的液体进行超速离心后获得沉淀,然后采用PBS重悬沉淀,并再次超速离心后回收沉淀,所获的沉淀即为寡孢节丛孢的细胞外囊泡;使用透射电镜观察细胞内多泡体和细胞外囊泡的形态;纳米颗粒跟踪分析检测囊泡浓度及粒径;S3、捕食线虫真菌寡孢节丛孢细胞外囊泡的荧光标记:利用BCA法对获得的寡孢节丛孢细胞外囊泡进行蛋白浓度定量分析,随后利用绿色荧光染料pKH67对细胞外囊泡进行荧光标记;S4、南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡:将蛋白浓度为100μg荧光标记的细胞外囊泡与南方根结线虫于28℃孵育培养96h;设置对照组:加入等体积的PBS与等量的南方根结线虫于28℃孵育培养96h;在荧光显微镜下观察南方根节线虫体内荧光定位情况。

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