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申请/专利权人：中国科学院昆明植物研究所

摘要：本发明提供了一种基于ITS序列和matK序列鉴定睡莲杂种的两个亲本的方法，属于植物分子鉴定技术领域，本发明的方法是基于一代测序得到睡莲杂种的双亲遗传的核基因组片段ITS序列和母系遗传的叶绿体基因组片段matK序列，将GenBank下载的ITS和matK序列，经过严格的筛选后分别建立睡莲属的ITS和matK序列数据库，通过将待测定亲本睡莲的ITS和matK序列分别与对应的数据库比对，基于遗传距离构建邻接树，并通过检查特异位点，从而得到待测定睡莲的父本和母本的信息。结果表明，基于GenBank下载并构建的睡莲属ITS和matK核苷酸序列数据库，通过测序待鉴定亲本的睡莲杂种的ITS序列和matK序列，能够通过遗传距离法鉴定得到睡莲杂种的母本和父本信息。

主权项：1.一种基于ITS序列和matK序列鉴定睡莲杂种的两个亲本的方法，该方法包括下述步骤：构建睡莲属ITS和matK核苷酸序列数据库：下载已有的睡莲属ITS和matK核苷酸序列；采取严格的过滤步骤，对ITS和matK序列每个“种单元”物种亚种变种变型杂交种保留一条序列；最后，比对后调整序列方向不一致的序列，然后重新比对后分别得到睡莲属ITS和matK核酸序列的数据库；整理最终得到的序列的序列名，格式为“物种名序列的ACCESSION”；构建睡莲属待测定亲本的物种的ITS单克隆序列和matK核苷酸序列：提取待测定亲本的睡莲的基因组DNA；设计引物；PCR序列扩增；一代测序；序列比对、构建邻接树，最后将单克隆测序的ITS和matK序列与已建立的对应的序列数据库比对，依据遗传距离构建邻接树并检查特异位点，得到睡莲杂种父本和母本的物种信息；其中，构建睡莲属ITS和matK核酸序列数据库的步骤如下：A.以“Nymphaea[Organism]AND5.8S[Title]NOTPREDICTED[Title]”和“Nymphaea[Organism]ANDmatK[Title]NOTPREDICTED[Title]”语法搜索美国国家生物技术信息中心（NCBI）核酸数据库（www.ncbi.nlm.nih.govucleotide），得到睡莲属全部的ITS和matK序列数据；同时以“chloroplast,completegenome[Title]ORplastid,completegenome[Title]ANDNymphaea[Organism]”语法得到59个已发表的睡莲属叶绿体基因组，并提取其中的matK序列；B.采取严格的过滤步骤，对ITS和matK序列每个“种单元”即物种亚种变种变型杂交种保留一条序列；C.比对后调整序列方向不一致的序列，然后重新比对后分别得到睡莲属ITS和matK核酸序列的数据库；其中，所述的过滤步骤为：a.去掉物种名含unverified、sp.和cf.的，保留种下等级亚种、变种、变型和明确的杂交种，简称其为“种单元”，将isolate、voucher、genotype、strain等都视为栽培种，将归在每个“种单元”内部；b.若“种单元”仅含一条序列，则不过滤；过滤后每个“种单元”最终仅保留一条序列；c.若步骤a中的栽培种的序列与“种单元”的序列差异较大，则去掉栽培种的序列；d.优先去掉编码区5.8SrRNA中差异明显过大的序列，优先去掉含未知碱基、简并碱基的序列，优先保留更长的序列；e.叶绿体基因组中提取得到matK序列仅作为补充使用，当测序得到的matK序列已有“种单元”，则舍弃从叶绿体基因组中提取得到的matK序列；f.最终保留的序列为最能代表该“种单元”的序列，即与多条序列得到的一致性序列最接近的序列；其中，所述的制备睡莲属待测定亲本的物种的ITS序列和matK序列步骤为：a.采用睡莲属18S、5.8S和25SrRNA的保守核苷酸序列参考植物条形码ITS通用引物设计睡莲属适用的ITS引物，采用睡莲属matK的保守核苷酸序列参考植物通用条形码引物设计睡莲属适用的matK引物；b.提取待测定亲本的睡莲的基因组DNA；c.以步骤b提取的待测定亲本的睡莲的基因组DNA为模版，利用步骤（a）设计的引物进行PCR扩增，分别得到ITS和matK序列的扩增产物；（d）.以步骤（c）得到的ITS序列的扩增产物，使用pLB零背景快速克隆试剂盒连接，并转化到DH5α感受态细胞，然后将挑取的菌斑经载体引物PCR扩增得到ITS序列克隆扩增的PCR扩增产物；（e）.将步骤（c）得到的matK序列的扩增产物和步骤（d）得到的ITS序列克隆扩增产物经一代测序仪测序，将测序结果进行序列拼接，得到待测定亲本的睡莲的matK序列和单克隆的ITS序列；所述的引物为：ITS-5，其核苷酸序列为AGTCGTAACAAGGTTTCCGT；ITS-3，其核苷酸序列为TAGTAACGGCGAGCGAACC； matK-5，其核苷酸序列为CGTACCGTACTTTTATGTTTACGAG； matK-3，其核苷酸序列为ACCCAATCCATCTGGAAATCTTGCTTC。

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