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申请/专利权人：鲲羽生物科技(江门)有限公司

摘要：本发明公开了一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用，该方法通过杂交探针的设计、探针预处理、样品杂交、连接反应、滚环扩增，仅需4轮连接测序即可解读上万种基因的原位空间转录表达谱。依据其探针设计特点又可应用于点突变以及甲基化位点原位检测。可实现单细胞、单分子、单碱基分辨的高通量基因原位解读。该方法的信号解读不依赖超分辨成像平台，推动了高通量原位空间转录组的普及和发展。

主权项：1.一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，该方法用于非诊断目的检测，其特征在于：包括以下步骤：1杂交探针的设计从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；其中，RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，loop序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成；所述loop序列的组成根据双barcode序列的测序方式不同，分为：当barcode序列为双端测序时，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、mid-anchor序列和barcode2序列其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，mid-anchor序列长度为15-30bp；当barcode序列为单向双barcode测序，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、anchor-1序列、barcode2序列和anchor-2序列；其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，anchor-1序列和anchor-2序列的长度为10-20bp；2探针预处理对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；3样品杂交在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；4连接反应将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；5滚环扩增RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；6barcode测序及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；b.同法依次解读锁式探针中barcode上的碱基序列信息；c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。

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