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申请/专利权人：武汉生之源生物科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种CYFRA21‑1测定试剂盒及其制备方法，将氯甲基磁珠包被CYFRA21‑1捕获抗体，获得磁珠包被抗体复合物，将所述磁珠包被抗体复合物使用磁珠稀释液稀释后获得试剂M；将CYFRA21‑1检测抗体使用还原剂溶液处理，获得活化后的抗体；碱性磷酸酶用酶活化剂活化，获得活化后的碱性磷酸酶；将所述活化后的抗体与所述活化后的碱性磷酸酶反应，获得酶标抗体复合物；将所述酶标抗体复合物使用酶标稀释液稀释后获得试剂R。本发明通过用氯甲基磁珠一步法包被捕获抗体，用还原剂处理断开检测抗体重链间二硫键后用碱性磷酸酶标记的方法来提高化学发光法检测CYFRA21‑1的线性范围和准确性。

主权项：1.一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述CYFRA21-1测定试剂盒包括R试剂、M试剂和校准品，所述制备方法包括：M试剂的制备：将磁珠包被后的抗体用M稀释液按照1:20的比例进行稀释，得到M试剂，所述M稀释液包括100mMPB、0.1%Tween20、0.5%BSA和0.1%PC-300，pH为7.5，所述磁珠包被后的抗体为氯甲基磁珠包被CYFRA21-1抗体，具体为：（1）取10mgmL氯甲基磁珠0.2mL于离心管中，去除上清液，用0.5mL的磁珠清洗液进行磁性分离洗涤3次，去除上清液，所述磁珠清洗液包括100mMMES和0.05%Tween20，pH6.0；（2）加入100μg的捕获抗体和0.5mL的偶联缓冲液，25℃偶联2-3h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态，偶联完成，去除上清液，所述偶联缓冲液包括100mM硼酸溶液，pH8.0-8.5；（3）加入0.5mL封闭缓冲液，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化基团，保持磁珠悬浮状态，封闭完成，去除上清液，用洗涤液清洗3次，所述封闭缓冲液包括100mMPBS和1%BSA，pH7.2；（4）加入1mL保存液保存，得到磁珠包被后的试剂M，保存在2-8℃条件下，所述保存液包括100mMTris、0.1%PC-300，pH8.0；R试剂的制备：将酶标记抗体用R稀释液按照1:500的比例进行稀释，得到R试剂，所述R稀释液包括100mM的Tris，0.9%NaCl，4mMMgCl2，0.4mMZnCl2，0.1%PC-300，5%甘油，1%BSA，5%胎牛血清，pH为6.5；所述酶标记抗体的制备方法为：取0.5mg的检测抗体，加入50mM的DTT还原剂，室温下反应30min，将抗体重链间的二硫键断开形成游离巯基；另取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂，室温下反应15min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶；所述酶活化剂包括100mMTris，0.3%NaCl，5mMEDTA，25mMSMCC交联剂；将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标抗体复合物；按照1:1的体积加入甘油保存，得到酶标抗体，保存在-20℃条件下；校准品的制备：将CYFRA21-1抗原用校准品稀释液配制成0ngmL、1ngmL、10ngmL、100ngmL、250ngmL、500ngmL的浓度，所述校准品稀释液包括50mMTris，0.9%NaCl，0.2%Tween20，0.2%酪蛋白，1%BSA，0.1%PC-300，pH为7.5。

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