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申请/专利权人：海南省农业科学院畜牧兽医研究所

摘要：本发明公开了一种m6A对鹅胚胎胸肌成肌细胞增殖调节的测定方法，包括上控制机架，选择鹅胚胎第15天E15和E30的胸肌，进行MeRIP‑seq转录组范围内胸肌成肌细胞增殖的m6A修饰，鉴定了5429个差异表达基因DEGs和6465个差异甲基化基因DMGs，在将DEGs与dmg重叠后，获得了3962个差异表达的甲基化基因DEMGs，进行了miRNA‑seq，获得了175个差异表达的mirnaDEMs，通过将dem的靶基因与demg重叠，获得了2837个共享基因，GO和KEGG分析显示，MAPK在MAPK信号通路中富集，与成肌细胞增殖有关，选择IGF2BP1进行整合基因组查看器可视化IGV，发现E15和E30之间IGF2BP1的m6A丰度存在显著差异，综上所述，推断miRNA联合m6A修饰在成肌细胞增殖中起关键作用。

主权项：1.一种m6A对鹅胚胎胸肌成肌细胞增殖调节的测定方法，其特征在于：包括步骤：S1，收集胸肌样本选择第15天E15和E30的鹅卵，在无菌条件下仔细摘除鹅胚后，收集左胸肌进行MeRIP-seq测序，收集右胸肌进行miRNA-seq测序，将胸膜组织样品快速冷冻到液氮中，并在-80℃下保存；S2，RNA提取和片段化使用Trizol试剂从丁安鹅胚胎的胸肌中提取总RNA，使用NanoDropND-1000定量RNA的质量和纯度，然后用生物分析仪2100鉴定RNA的完整性，并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行确认；使用DynabeadsOligodT25-61005进行两轮纯化，从50μg的总RNA中纯化PolyAmRNA，将镁RNA片段模块加入到纯化的PolyAmRNA中，将模块在94℃处片段化5-7min；S3，m6A-seq和RNA-seq文库的构建将RNA片段被分为两部分，其中一部分与m6a特异性抗体在IP缓冲液中，4℃处理2小时，采用dUTP方法，利用IP产物构建片段大小为300±50bp的链特异性cDNA文库；剩下的10％的RNA片段作为未经处理的输入对照，直接构建常规的转录组测序文库，m6AIP库和输入库采用TMTM6000进行PE150模式测序，按照双端测序标准程序进行测序。S4，M6A甲基化峰筛选和差异M6A数据的获得使用R软件包exomepeak2对干净数据进行峰值调用和差分峰值分析，并使用整合基因组查看器进行可视化。对峰进行了注释。与至少一个m6A峰重叠的基因称为m6A基因，使用R包ChIPseeker注释m6A基因功能元件，同时，利用MEME2和HOMER鉴定了m6A峰中富集的基序，使用获得显著差异m6A峰，通过显著差异m6A峰获得显著差异m6A峰重叠的基因定义为差异甲基化基因DMGs；S5，差异表达基因的获得使用StringTie对基因表达的定量进行归一化处理，并使用FPKM＝[totalgenesexonfragmentsmappedreadsmillions×exonlengthkB]计算每千碱基每百万个映射reads，使用R包edgeR对差异表达基因进行分析，采用筛选差异表达基因DEGs；S6，将DEGs与DMGs重叠，获得了差异表达的甲基化基因DEMGs。

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