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申请/专利权人：山东师范大学

摘要：本发明涉及一种无标记荧光检测FEN1活性的方法。本发明提供了一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法用于无标记荧光检测FEN1活性的方法；通过环形DNA底物识别FEN1，并以环形DNA序列作为模板实现超支化滚环扩增。该方法操作简单，经济有效，特异性强，可以超灵敏检测FEN1。此外，它还可用于筛选FEN1抑制剂和定量检测癌细胞中的FEN1活性，在临床诊断和药物发现方面具有巨大的潜在应用价值。

主权项：1.一种非诊断和治疗目的的无标记荧光检测FEN1活性的方法，其特征在于，所述检测方法涉及环形DNA底物、引物1及引物2；所述环形DNA底物由带5’分枝结构的挂锁探针与辅助探针杂交形成；所述检测方法包括以下步骤：将环形DNA底物投入待测样品中混合孵育诱导裂解，裂解后所述环形DNA底物中分支结构被切除暴露出5’端磷酸基团的缺口；将裂解反应产物与DNA连接酶混合，通过DNA连接酶对上述缺口进行连接获得闭合的环形序列；将连接反应产物、核酸外切酶I及核酸外切酶III混合，对环形DNA底物中的辅助探针进行消化；将消化反应产物、引物1和引物2及dNTPs混合升温孵育一段时间后加入DNA聚合酶，以闭合的环形序列为模板引发超支化滚环扩增，对扩增产物进行定量检测即可获得FEN1活性；所述的检测方法中，所述环形DNA底物由挂锁探针及辅助探针杂交形成，所述挂锁探针5’端向3’端方向为一段单核苷酸链及环形序列，所述单核苷酸链即为分支结构，所述环形序列两个末端与辅助探针配对，在辅助探针的作用下成环，形成挂锁探针；所述环形DNA底物的制备方式如下：将挂锁探针及辅助探针加入含MgCl2的Tris缓冲液中加热孵育，孵育完成后缓慢冷却至室温形成；所述孵育温度为90~100℃，所述孵育时间为3~8min；或，所述引物1能够识别并结合挂锁探针的环形序列并进行延伸，所述引物2能够识别上述延伸序列实现超支化滚环扩增；所述挂锁探针、辅助探针、引物1及引物2的序列分别如下：挂锁探针：TTTTAGAACTATATTGTCTTTCTCTGATTCTGACTCGTCATGTCTCAGCTTTAGTTTAATACGACTCCATAGGGCTCAGTGTGATTCCACCTTCTCCAA;辅助探针：CAGAGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAATCACACTGAG;引物1：CTAAAGCTGAGACATGACGAGTC;引物2：CTCAGTGTGATTCCACCTTCTCC。

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