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申请/专利权人：赣南医学院

摘要：一种基于Arah2IgE表位精准识别评价花生致敏性的方法，包括：Arah2的提取及纯化；Arah2IgE表位单克隆抗体的制备；Arah2IgE表位多克隆抗体的制备；表位抗体对Arah2IgE表位肽的识别能力分析；以IgE表位单克隆抗体为捕获抗体，IgE表位多克隆抗体为检测抗体，Arah2为抗原，建立检测Arah2的夹心ELISA方法标准曲线；待检样品的预处理；样品的检测；样品中花生致敏性的评价；量效关系的建立。本发明制备的抗体能特异性识别Arah2的IgE表位，建立的夹心ELISA方法具有通过精准检测Arah2IgE含量来快速预测花生致敏性的能力，具有良好的推广和应用前景。

主权项：1.基于Arah2IgE表位精准识别评价花生致敏性的方法，其特征包括以下步骤：（1）Arah2的提取及纯化；（2）Arah2IgE表位单克隆抗体的制备：选取Arah2的一个主要IgE表位DRRCQSQLER，并在其N端加一个甘氨酸用于连接载体蛋白，然后利用杂交瘤技术制备特异性识别该IgE表位的鼠单克隆抗体；（3）Arah2IgE表位多克隆抗体的制备：a）基于表位疫苗设计原理，以花生Arah2的IgE表位B1：AA18–27；B2：AA24–31；B3：AA30–39；B4：AA42–51；B5：AA52–59；B6：AA62–67；B7：AA68–75；B8：AA92–103；B9：AA110–116；B10：AA120–125；B11：AA130–135；B12：AA146–153、T细胞表位T：AA94–113及间隔序列GGGG为基础，构建表位串联体分子：T-GGGG-B1-GGGG-B2-GGGG-B3-GGGG-B4-GGGG-B5-GGGG-B6-GGGG-B7-GGGG-B8-GGGG-B9-GGGG-B10-GGGG-B11-GGGG-B12；b）合成串联体基因后，通过原核表达技术制备Arah2表位串联体重组蛋白；c）以表位串联体重组蛋白为免疫原，按常规技术制备表位串联体重组蛋白多克隆抗体；（4）表位抗体对Arah2IgE表位肽的识别能力分析：以Arah2为包被抗原，表位肽为竞争抗原，表位抗体为一抗，采用间接竞争ELISA方法分析表位抗体对表位肽的识别能力；根据吸光值计算不同浓度表位肽的抑制率，根据抑制率高低得出表位抗体对不同表位肽识别能力的强弱；用下面公式计算抑制率PI：PI%=[1-A1-A0A2-A0]×100%其中，A0为空白孔的吸光值；A1为竞争肽对应的吸光值；A2为不加竞争肽的吸光值；（5）以IgE表位单克隆抗体为捕获抗体，IgE表位多克隆抗体为检测抗体，Arah2为抗原，建立检测Arah2的夹心ELISA方法标准曲线；（6）待检样品的预处理：a）纯花生样品：将花生仁磨成酱，用丙酮对花生酱进行脱脂；离心除去上清，将沉淀风干，获得脱脂粉；用浸提液提取脱脂粉中的花生蛋白，通过离心去除沉淀，用封阻液将上清液稀释至线性检测范围内作为待检样品；b）液态样品：取一定量的液态样品于离心管中，通过离心除去脂肪和沉淀，用封阻液将上清液稀释至线性检测范围内作为待检样品；c）固态样品：样品磨成成粉末后，用提取液提取样品中的蛋白质，通过离心去除沉淀和脂肪，用封阻液将上清液稀释至线性检测范围内作为待检样品；（7）样品的检测：利用所建立的夹心ELISA方法对待检样品中的Arah2进行检测，把所测吸光值带入标准曲线计算出被检样品中Arah2及其致敏性残基的含量；（8）样品中花生致敏性的评价：以生花生提取液为包被抗原，预处理的样品为竞争抗原，花生过敏患者血清池为一抗，采用间接竞争ELISA法分析样品中花生的IgE结合能力，评价样品的花生致敏性；根据吸光值计算不同稀释度样品的抑制率，样品中花生的致敏性与半抑制稀释度成正比；（9）量效关系的建立：以生花生提取液为阳性样本，计算其他样品中测得的Arah2浓度及半抑制稀释度与阳性样本的比值，绘制Arah2浓度比值和半抑制稀释度比值两条曲线，建立Arah2浓度与花生致敏性的量效关系，根据曲线变化趋势判断所建夹心ELISA方法通过精准检测Arah2IgE表位含量来预测花生致敏性的能力。

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