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申请/专利权人：上海君实生物医药科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种冠状病毒S蛋白RBD糖蛋白的制备方法及其应用。本发明提供了制备具有哺乳动物糖型结构N‑糖链修饰的冠状病毒S蛋白RBD的方法，包括：在经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母甘露糖基化修饰途径缺陷、并重构了哺乳动物细胞N‑糖基化修饰途径的巴斯德毕赤酵母细胞突变体中表达冠状病毒S蛋白RBD，得到重组酵母细胞；培养重组酵母细胞，从培养上清中纯化获得目的蛋白。本发明成功表达了具有哺乳动物糖型结构N‑糖链修饰的冠状病毒S蛋白RBD，用其免疫小鼠后能够产生高滴度抗体，且能够中和SARS‑CoV‑2病毒。本发明利于进行新型冠状病毒疫苗高效研发和大规模生产。

主权项：1.制备具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状病毒S蛋白受体结合区的方法，包括如下步骤：（1）在经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中表达冠状病毒S蛋白受体结合区，得到重组酵母细胞；所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母为甘露糖基化修饰途径缺陷、并重构了哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径的巴斯德毕赤酵母细胞突变体；（2）培养所述重组酵母细胞，从培养上清中纯化获得具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状病毒S蛋白受体结合区；其中，所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母是按照包括如下步骤的方法制备得到的：（A1）失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶IV，得到重组酵母1；（A2）在所述重组酵母1中表达如下外源蛋白：外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶，得到重组酵母2；和（A3）失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，得到重组酵母3；所述重组酵母3为所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母；其中，所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL；所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I来源于人，且含有mnn9定位信号；所述外源甘露糖苷酶II来源于线虫，所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II来源于人，且均含有mnn2定位信号；所述外源半乳糖异构酶和所述外源半乳糖转移酶为融合蛋白，均来源于人，且共用一个kre2定位信号；其中，所述外源甘露糖苷酶I的编码基因和所述外源甘露糖苷酶II的编码基因均向所述重组酵母1中导入两次；其中，所述冠状病毒S蛋白受体结合区为如下任一：（a1）SEQIDNo.21所示蛋白质；（a2）SEQIDNo.22所示蛋白质；（a3）SEQIDNo.23所示蛋白质；（a4）SEQIDNo.24所示蛋白质。

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