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申请/专利权人：临沂大学

摘要：本发明公开一种双酶型免疫荧光系统检测痕量黄曲霉毒素B1的方法，属于黄曲霉素检测技术领域。本发明利用MNPs‑PEG‑Apt对AFB1的特异性识别，通过AFB1‑COD和AFB1进行竞争，上清液中剩余的AFB1‑COD可以氧化胆碱生成H2O2，加入底物ADHP后，HRP催化ADHP‑H2O2反应，ADHP被氧化后呈现红色的荧光，我们以此来对AFB1进行定量检测。该AFB1的检测方法的线性范围是1.5‑15ngmL，检测限是1.32ngmL。与传统的方法相比，本实验对样品的前处理步骤较简单，所需要的仪器设备也很简单，研究方法快速便捷且易于操作和观察，具有更高的灵敏度。得到了比较好的结果反馈。

主权项：1.一种双酶型免疫荧光系统检测痕量黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：1磁性Fe3O4纳米粒子MNPs制备：将1.625gFeCl3·6H2O和0.60gNa3Cit·2H2O溶于40mL乙二醇中，搅拌2h后，得到棕红色透明溶液；将10mL透明的乙二醇和3gNaAc的混合液滴加到棕红色透明溶液中，在室温下猛烈搅拌40min，得到均匀的前驱体溶液；然后将均匀的前驱体溶液密封在100mL特氟龙衬里的不锈钢高压釜中，200℃恒温反应10小时，冷却至室温后，用外加磁铁分离黑色产物，用乙醇和去离子水洗涤三次，然后将固体在60℃真空干燥12h后，得到表面具有羧基基团的磁性Fe3O4纳米粒子MNPs；2MNPs-PEG-Apt的制备：将步骤（1）所得表面具有羧基基团的磁性Fe3O4纳米粒子MNPs分散于PBS缓冲液中，制备为1mgmL、pH=6的羧基化的MNPs溶液；取10mL羧基化的MNPs溶液，再加入2.9mgEDC和3.25mgNHSS，室温下振荡器活化1h，转速为150rpmmin；在外加磁场的作用下分离MNPs，并用PBS缓冲液洗涤三次，得到活化MNPs；将得到的活化MNPs分散在10mLPBS缓冲液中，加入45mg的PEG，所述PEG一端为氨基，另一端为羧基，室温下振荡三小时，在外部磁场的作用下洗涤三次，得到MNPs-PEG；将MNPs-PEG重新分散在10mL的PBS缓冲溶液中，加入2.9mgEDC和3.25mgNHSS，1h后分离MNPs-PEG并洗涤，得到活化MNPs-PEG；再将活化MNPs-PEG分散在10mLPBS缓冲溶液中，将预先在95℃加热5min并在4℃下冷却10min的5μM的Apt加入到活化MNPs-PEG的PBS缓冲溶液中，并在37℃下恒温振荡3h，再加入质量浓度为2％牛血清白蛋白封闭1h；反应结束后，用pH=7.2的PBS缓冲溶液洗涤三次，将所得的MNPs-PEG-Apt分散在10mLPBS缓冲溶液中，并在4℃避光储存，备用；所述Apt的核酸序列为：NH2-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC；3AFB1-COD偶联物溶液的制备：将1mg的AFB1和2mg的CMO溶于2mL吡啶中，将混合物涡旋并在室温下避光孵育24小时；用氮气除去吡啶后，得到肟化产物AFB1-肟，将AFB1-肟溶于1mL、pH=8.0的超纯水中，用1molLHCl将溶液调节至pH=2.0，并在4°C下放置15分钟静置沉淀；通过离心收集沉淀物，并用0.5mL氯仿和0.5mL乙酸乙酯的混合液重复提取五次，将提取后的氯仿和乙酸乙酯与5mL、pH=2.0超纯水混合并放置过夜；通过氮气干燥收集提取的AFB1-肟；然后，将721μgAFB1-肟、1.1mgNHS和11mgDCC溶于1mL无水THF中，并在室温下避光振荡1h；通过离心去除沉淀物，同时在55°C的水浴中用氮气干燥上清液，得到AFB1的酯化产物AFB1-酯，并将AFB1-酯溶解在DMF中，使AFB1-酯类的最终浓度为1mgmL；按照1:1的摩尔比将AFB1-酯溶液逐滴加入COD溶液中，在4℃下持续振荡4小时后，用PBS缓冲液透析48小时，然后用PBS定容至10mL,得到AFB1-COD偶联物溶液，储存在4℃下以备进一步使用；4制作标准曲线：将步骤（3）得到的AFB1-COD偶联物溶液稀释后使用，取100μLMNPs-PEG-Apt加入到500μLAFB1-COD偶联物稀释液中得到混合溶液，将50μL一系列不同浓度的AFB1标准溶液分别加入到上述混合溶液中，室温振荡竞争40min，取250μL的上清液加入250μL3.63fML的胆碱并振荡均匀，调节体系pH为12.13，室温下静置孵育20min；孵育完成后取100μL该溶液加入到由200μL50μMLADHP和200μL0.025μMLHRP组成的发光溶液中，在40℃下恒温孵育35min后用荧光分光光度计扫描光谱图，激发波长为535nm，观察585nm处的荧光光谱的峰值变化；以AFB1的浓度为横坐标，585nm处的荧光强度为纵坐标绘制出标准曲线；5样品中黄曲霉素的提取与检测：称取5g待测样品于50mL离心管中，加入20mL甲醇的水溶液，涡旋混匀，置于摇床中振荡20min，在6000rmpmin下离心10min，用旋转蒸发仪将上清液蒸发至干燥，用1mL质量浓度为70％甲醇配制成溶液，过0.22μm滤膜，并在氮气气流下，50℃蒸发至干燥；将干燥的实际样品中加入100μLMNPs-PEG-Apt和500μLAFB1-COD偶联物稀释液，室温下振荡竞争40min，取250μL的上清液加入250μL3.63fML的胆碱并振荡均匀，调节体系pH为12.13，室温下静置孵育20min；孵育完成后取100μL该溶液加入到由200μL50μMLADHP和200μL0.025μMLHRP组成的发光溶液中，在40℃下恒温孵育35min后用荧光分光光度计扫描光谱图，激发波长为535nm，观察585nm处的荧光光谱的峰值，带入标准曲线，得到黄曲霉素浓度数值；步骤（4）和（5）中AFB1-COD偶联物稀释液的浓度为3.0μgmL。

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