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申请/专利权人：杭州微远生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种维生素MK‑4的生物酶法制备工艺，包括以下步骤：（1）二甲基烯丙基二磷酸的合成，（2）异戊烯基二磷酸的合成，（3）香叶酰香叶酰二磷酸的合成，（4）MK‑4的合成。本发明大大缩短了合成路线，同时采用廉价原料作为出发底物，大大降低了MK‑4的生产成本，且兼具生物法的相关优势比如污染少、操作简便等。相比于化学合成法和传统的微生物发酵法，本发明在产率和生产成本方面具有极大优势，另外本发明的新生物合成路线所得MK‑4产品并不掺杂有MK‑6，产品纯度高，减少了后续分离纯化的难度。

主权项：1.一种维生素MK-4的生物酶法制备工艺，其特征在于，采用体外全酶法合成，包括以下步骤：（1）二甲基烯丙基二磷酸的合成：异戊烯醇在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:945142的羟乙基噻唑激酶催化下生成二甲基烯丙基单磷酸；二甲基烯丙基单磷酸在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:1450882的磷酸异戊烯基激酶催化下生成二甲基烯丙基二磷酸；（2）异戊烯基二磷酸的合成：异戊二烯醇在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:945142的羟乙基噻唑激酶催化下生成异戊烯基单磷酸；异戊烯基单磷酸在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:1450882的磷酸异戊烯基激酶催化下生成异戊烯基二磷酸；（3）香叶酰香叶酰二磷酸的合成：二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸在EC2.5.1.10且NCBIGeneID:945064的法尼酰二磷酸合酶催化下生成香叶酰香叶酰二磷酸；（4）MK-4的合成：香叶酰香叶酰二磷酸和维生素K3一起在EC2.5.1.M22且NCBIGeneID:HS04454的香叶酰香叶酰转移酶催化下生成目标产物MK-4；本步骤还添加有抗坏血酸，酶促反应体系各原料添加量为：香叶酰香叶酰二磷酸1~200gL，维生素K31~40gL，抗坏血酸0.1~5gL，香叶酰香叶酰转移酶0.5~50mgL；催化反应温度为20~40℃，pH控制在6-8，全程避光；体外全酶法合成的步骤（1）和步骤（2）中，添加ATP作为辅因子并提供能量；所述ATP由ATP循环系统提供，ATP循环系统包括EC2.7.4.1且NCBIGeneID:946971的ADP激酶、循环启动用ATP和焦磷酸钠，其中ADP激酶浓度为0.1~10mgL，循环启动用ATP初始添加浓度为50~1000mgL，焦磷酸钠初始添加浓度为50~1000mgL，在酶促反应温度下进行循环，焦磷酸钠每隔1.5~2小时补加一次；或采用细胞内合成，包括以下步骤：（1）二甲基烯丙基二磷酸的合成：异戊烯醇在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:945142的羟乙基噻唑激酶催化下生成二甲基烯丙基单磷酸；二甲基烯丙基单磷酸在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:1450882的磷酸异戊烯基激酶催化下生成二甲基烯丙基二磷酸；（2）异戊烯基二磷酸的合成：异戊二烯醇在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:945142的羟乙基噻唑激酶催化下生成异戊烯基单磷酸；异戊烯基单磷酸在EC2.7.1.50且NCBIGeneID:1450882的磷酸异戊烯基激酶催化下生成异戊烯基二磷酸；（3）香叶酰香叶酰二磷酸的合成：二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸在EC2.5.1.10且NCBIGeneID:945064的法尼酰二磷酸合酶催化下生成香叶酰香叶酰二磷酸；（4）MK-4的合成：香叶酰香叶酰二磷酸和维生素K3一起在EC2.5.1.M22且NCBIGeneID:HS04454的香叶酰香叶酰转移酶催化下生成目标产物MK-4；本步骤还添加有抗坏血酸，酶促反应体系各原料添加量为：香叶酰香叶酰二磷酸1~200gL，维生素K31~40gL，抗坏血酸0.1~5gL，香叶酰香叶酰转移酶0.5~50mgL；催化反应温度为20~40℃，pH控制在6-8，全程避光。

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