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申请/专利权人：吉林农业科技学院

摘要：本发明公开了肉桂精油对黄曲霉的抑制机制及应用技术领域的一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法，步骤一：肉桂精油提取：采用传统蒸馏与萃取结合的方法进行肉桂精油的提取，将桂皮清洗后阴干，用研钵磨碎成小块，称取20.0g桂皮及适量玻璃珠加入到蒸馏烧瓶内，加入250mL蒸馏水加热，煮沸6h后收集馏出液，馏出液中加入60mL二氯甲烷（DCM）混匀萃取，重复操作3次收集DCM溶液，加入无水CaCl2脱水，抽滤，滤液加热蒸馏2h后收集烧瓶中澄清黄色液体即为肉桂精油，棕色瓶密封4℃储存，供分析使用；肉桂精油对黄曲霉的最低抑制浓度为0.5μLmL，首次阐明了肉桂精油抗黄曲霉毒素产生作用的分子机制，肉桂精油对薏苡仁黄曲霉感染有显着的抑制作用。

主权项：1.一种肉桂精油对薏苡仁中黄曲霉的抑制方法，其方法包括如下步骤，其特征在于：步骤一：肉桂精油提取：采用传统蒸馏与萃取结合的方法进行肉桂精油的提取，将桂皮清洗后阴干，用研钵磨碎成小块，称取20.0g桂皮及适量玻璃珠加入到蒸馏烧瓶内，加入250mL蒸馏水加热，煮沸6h后收集馏出液，馏出液中加入60mL二氯甲烷（DCM）混匀萃取，重复操作3次收集DCM溶液，加入无水CaCl2脱水，抽滤，滤液加热蒸馏2h后收集烧瓶中澄清黄色液体即为肉桂精油，棕色瓶密封4℃储存，供分析使用；步骤二：黄曲霉毒素的提取及测定：取1mL浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μLmL的肉桂精油加入装有29mLPDB培养基的三角瓶中，摇匀，对照组加入1mL的0.1%Tween-80，向三角瓶中加入一定体积的黄曲霉孢子悬液，使其终浓度为1×106CFUmL，在28℃、140rpm条件下震荡培养3d，吸取培养液，将培养液通过0.22μm有机滤膜滤过，80%色谱乙腈稀释后进行仪器分析检测毒素含量；步骤三：质膜分析：胞内蛋白渗漏采用不同浓度（0、0.125μLmL、0.25μLmL）CEO处理的黄曲霉菌丝体中渗漏蛋白的含量，采用培养液进行测定，通过BCA蛋白测定试剂盒测定每个样品中的蛋白质含量；菌丝体麦角甾醇含量过滤收集菌丝体，用生理盐水冲洗3次，用滤纸吸去多余的水，称取湿菌丝体1g，加入5mL25%氢氧化钾-乙醇溶液，剧烈振荡5min，然后在85℃水浴中孵育，孵育4小时后，加入2mL无菌水和5mL正己烷，涡旋2分钟，然后，分离正己烷层并在紫外可见分光光度计（230～300nm）下检测，麦角甾醇（282nm）和脱氢麦角甾醇（282nm和230nm）的出现产生了特征吸收峰；步骤四：肉桂精油抑制黄曲霉生长和产生黄曲霉毒素作用机制：A.flavus菌种活化孢子悬液的制备，将黄曲霉菌株接种于PDA综合培养基上，置于恒温恒湿培养箱中28℃、90%RH条件下培养5d，待平板长满菌丝且呈黄绿色时，在PDA培养基上加入5mL的0.1%（vv）Tween-80，用移液器反复吹打，将孢子冲下并涡旋混匀，在显微镜下通过血球计数板（25×16）观察孢子并计数，孢子悬液在4℃冰箱保存，备用；肉桂精油对A.flavus孢子萌发影响取2mLPDB培养基作为孢子生长的营养物质，在24孔细胞培养板中加入200μL1×107CFUmL的孢子悬液，对照组中加入200μL0.1%Tween-80，加入200μL不同浓度肉桂精油，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μLmL，在恒温恒湿培养箱中28℃、90%RH条件下培养，分别在6h、9h、18h、24h、36h、48h、72h时利用倒置显微镜观察孢子生长及萌发情况，当芽管长度超过孢子直径一半时，视为孢子进入萌发阶段，直到对照完全萌发；步骤五：肉桂精油对A.flavus菌丝生长的影响制备精油抗性平板：在无菌培养皿中加入19mLPDA培养基，趁热加入1mL不同浓度的肉桂精油，混匀，冷却，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μLmL，在精油抗性平板中心接种10μL浓度为1×106CFUmL孢子悬液，在28℃、90%RH条件下培养5d，采用十字交叉法测定菌落直径，最小抑菌浓度（MIC）为抑制可见菌丝生长的最低肉桂精油浓度；肉桂精油对A.flavus超微结构的影响在PDA综合培养基中加入不同浓度的肉桂精油，使其终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μLmL，以0.1%Tween-80的为对照组，在恒温恒湿培养相中28℃、90%RH条件下培养5d，从培养基上切下边长为3mm的正方体，浸泡在2.5%戊二醛中固定16h，固定前期要经常摇动，使用0.2molLPBS缓冲溶液清洗2次，15～20min次，充分摇动；依次用浓度为50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇溶液进行洗脱，每个梯度浸泡2次，无水乙醇浸泡洗脱3次，洗脱时间15～20min；加入叔丁醇浸泡，37℃水浴加热，15～20min次浸泡两次；冷冻干燥：液态浸泡的组织块置于专用器皿中，抽真空，制冷3～4h后粘贴，喷金，在10.0kV下用扫描电镜观察孢子和菌丝体形态特征；肉桂精油对黄曲霉毒素产生的影响取1mL浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5μLmL的肉桂精油加入装有29mLPDB培养基的三角瓶中，摇匀，对照组加入1mL的0.1%Tween-80，向三角瓶中加入一定体积的黄曲霉孢子悬液，使其终浓度为1×106CFUmL，在28℃、140rpm条件下震荡培养3d，吸取培养液，将培养液通过0.22μm有机滤膜滤过；步骤六：薏苡仁的灭菌与接种：薏苡仁在2%次氯酸中浸泡5min，晾干，称取10g大小均一的薏苡仁，平铺于已灭菌的扩散皿外环，准确吸取1mLA.flavus孢子悬液，接种到已灭菌处理的薏苡仁样品中，将1mL不同浓度的肉桂精油加入到扩散皿内环，快速盖好玻璃片，实验组的最终精油浓度为0、0.5、1、2、5、7.5、10、12、15和20µLg，对照组中加入1mL0.1%Tween-80，将实验组和对照组的培养皿均移入恒温恒湿培养箱中28C、90%相对湿度下培养15d，观察黄曲霉菌的生长情况，每个实验平行重复3次。待培养结束后，将实验组和对照组薏苡仁装入密封袋中，-20℃冰箱保存，备用；步骤七：结果与分析：肉桂精油采用水蒸气蒸馏与有机溶剂萃取结合的方法进行提取，第一次蒸馏收集的馏出液体积为136mL，第二次蒸馏去除DCM后收集精油称重为0.631g，根据公式计算肉桂精油取率为3.155%，对肉桂精油进行GC-MS分析后可得到其总离子色谱图，据NIST质谱库比对和文献中相应数据对化合物进行鉴定，肉桂精油中共鉴定出16种主要化合物，占化合物总量的99.64%，含量最丰富的化合物是肉桂醛（79.03%），其次是可巴烯（5.46%）、苯丙醛（2.7%）、乙酸肉桂酯（2.64%）、（+）-δ-杜松烯1.97%和2'-甲氧基肉桂醛1.15%，主要成分与Wang等的结果一致，但与Ganić等和Minozzo等的研究结果不同，其报道了反式肉桂醛是肉桂精油的主要成分；肉桂精油对A.flavus孢子萌发影响显微镜下观察黄曲霉孢子的萌发状态，8h时对照组孢子完全萌发，结果表明，肉桂精油对黄曲霉孢子萌发具有抑制作用，且呈浓度依赖效应，随着肉桂精油浓度的增大，其对黄曲霉孢子萌发抑制率逐渐升高，当肉桂精油浓度为0.5μLmL时，抑制率高达100%，从孢子形态观察及萌发抑制率测定结果可以发现，肉桂精油能显著抑制黄曲霉孢子萌发，推测可能是损伤DNA从而达到对黄曲霉孢子萌发的抑制作用；肉桂精油对菌丝生长的影响抑菌圈直径大小可反映测试菌对精油的敏感程度，肉桂精油浓度与黄曲霉菌的生长呈负相关，即精油浓度越大，菌落直径越小，通过测量培养5d时菌丝的生长直径，得出肉桂精油对菌丝生长的抑制率，当肉桂精油浓度为0.0625μlmL时菌落直径减少18.58%，当肉桂精油浓度为0.125μlmL时菌落直径减少37.69%，当肉桂精油浓度为0.25μlmL时菌落直径减少46.78%，当肉桂精油浓度为0.5μlmL时完全抑制菌丝生长，继续培养到14d时依然没有菌落出现，说明肉桂精油对黄曲霉菌具有较强的抑菌活性，其MIC和MFC为0.5μlmL；肉桂精油对污染薏苡仁中黄曲霉的抑制作用肉桂精油对接种黄曲霉菌孢子悬液的薏苡仁的作用，随着肉桂精油浓度的不断增加，对薏苡仁中黄曲霉菌的抑制作用也逐渐增强，薏苡仁霉变最严重，表面附着一层厚厚的黄绿色霉菌；当精油浓度为1.0µLg时，薏苡仁霉变情况较对照组有所减轻，但黄曲霉菌仍然较多；当精油浓度为2.5µLg、5.0µLg、7.5µLg时，薏苡仁的霉变程度明显降低，随着肉桂精油浓度增加，薏苡仁表面的霉菌颜色由黑绿色转为白色；当精油浓度为10.0µLg时，薏苡仁表面未观察到黄曲霉菌的生长。

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