买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国农业科学院特产研究所

摘要：一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，涉及细胞生物学技术领域。为了更直观的观察细胞所处时期及膜蛋白NHE1和微丝的共定位情况，本发明提供了一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，包括如下步骤：从性成熟的猪卵泡内抽取的卵丘‑卵母细胞复合体，经培养后，获得生发泡期GV、第一次成熟分裂前期GVBD、第一次成熟分裂中期MI、第二次成熟分裂中期MII卵母细胞，然后依次经透明质酸酶去除卵丘细胞、链霉蛋白酶去除透明带后，将各时期的猪卵母细胞经透膜、封闭后，经抗体孵育后染核制备封片，在多通道共聚焦显微镜下进行观察。本发明为研究猪卵母细胞膜蛋白NHE1及其他膜蛋白的分子机制提供新的技术支持。

主权项：1.一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法，其特征在于，包括如下步骤：1猪卵母细胞培养：在性成熟的猪卵泡内抽取卵丘-卵母细胞复合体，经成熟培养液漂洗后转入成熟培养液于培养箱中进行培养，分别在0、24、30和44h收集生发泡期GV、第一次成熟分裂前期GVBD、第一次成熟分裂中期MI、第二次成熟分裂中期MII卵母细胞；2固定：将步骤1中收集的各时期的猪卵母细胞分别用含透明质酸酶的Medium199培养液反复吹打去除颗粒细胞，洗净颗粒细胞的猪卵母细胞，在含链霉蛋白酶和血清的Medium199培养液中去除透明带，在添加了BSA的4％质量分数多聚甲醛中清洗后，再置于4％质量分数多聚甲醛中室温固定30min；所述透明质酸酶在Medium199培养液中的质量分数为2％；所述链霉蛋白酶在Medium199培养液中的质量分数为0.5％；所述血清在Medium199培养液中的质量分数为5％；所述BSA在4％质量分数多聚甲醛中的质量含量为0.03％；3透膜：将固定好的各猪卵母细胞分别经透膜液中清洗后，再置于透膜液中于37℃透膜8-48h；所述透膜液为质量分数为1％的TritonX-100溶液；4封闭：将透膜后的各猪卵母细胞分别经封闭液清洗后，置于封闭液中封闭至少1h；5孵育第一抗体：将上述各猪卵母细胞分别放入到2％体积分数的兔抗NHE1的IgG中，4℃孵育第一抗体12-24h；6孵育第二抗体：然后，将步骤5中的各猪卵母细胞表面没有与NHE1结合的第一抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到0.2％体积分数的FITC标记的羊抗兔二抗中，室温孵育第二抗体1-2h；7孵育鬼笔环肽：然后，将步骤6中猪卵母细胞表面没有与第一抗体结合的第二抗体洗掉后，将各猪卵母细胞分别加入到2.5％体积分数的鬼笔环肽中，室温孵育鬼笔环肽0.5-1h；8染核：将上述猪卵母细胞表面的鬼笔环肽洗掉后，在载玻片上室温孵育DAPI，10min后封片；9检测：选用多通道共聚焦显微镜观察封片后的猪卵母细胞。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国农业科学院特产研究所 一种猪卵母细胞膜蛋白NHE1荧光染色的方法