买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明一种使用鱼鳃细胞测定微藻溶血活性的方法，包括以下步骤：1）微藻细胞的培养；2）微藻细胞上清液的制备；3）藻细胞破碎液的制备；4）鱼鳃细胞培养；5）溶血毒素活性检测。本发明通过采用鱼鳃细胞进行微藻溶血活性的测定，可有效解决现有技术中溶血毒素活性检测出现的假阳性问题，同时避免使用活体生物进行测定，本测定方法简单易行，检测时间短，便于对赤藻发生进行提前预警。

主权项：1.一种使用鱼鳃细胞测定微藻溶血活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）微藻细胞的培养：取实验室单细胞分离培养的鱼毒性赤潮藻细胞，培养于Guillard’sf2或f2-Si培养基中，待用；2）微藻细胞上清液的制备：取一定量对数生长期的步骤1）培养的藻细胞，于4℃的温度条件下离心，取上清液，常温备用；3）藻细胞破碎液的制备：取一定量对数生长期的步骤1）培养的藻细胞，于冰水浴的条件下，使用超声波细胞破碎仪对藻细胞原液进行破碎，破碎后的原液用带有0.22µm尼龙滤膜的注射器过滤，收集滤液即制得藻细胞破碎液，样品置于常温避光备用；4）鱼鳃细胞培养：将从虹鳟鳃丝分离得到的RTgill-W1鱼鳃细胞系，培养在细胞培养瓶中，使用Leibovitz’sL-15完全培养基培养鱼鳃细胞，细胞培养在18~21°C黑暗条件下进行，当细胞融合度达到85%以上时，进行细胞传代培养，制得鱼鳃细胞，待用；5）溶血毒素活性检测：将步骤4）培养的鱼鳃细胞经胰蛋白酶细胞消化液分离，用血球计数板计数，使用L-15完全培养基调整细胞密度至2×105ml，将鳃细胞接种于96孔板，20℃黑暗条件下静置24h使细胞附着，吸弃L-15培养基，用PBS冲洗细胞，将鳃细胞在20℃光照条件下分别暴露于微藻细胞原液、上清液、及藻细胞破碎液中，对照组则暴露于经0.22μm醋酸纤维滤膜过滤的灭菌（110℃，25min）海水中，暴露1h；新鲜配制5%vvAlamarBluein1%L-15ex溶液工作液并避光，将每个孔中的上清吸出并用PBS洗涤后，加入AlamarBlue工作液，用铝箔覆盖，19℃孵育2h，同时将5%vvAlamarBluein1%L-15ex溶液应用于空孔中作为空白对照，检查仪器产生的背景信号；使用酶标仪检测AlamarBlue的荧光信号，并通过公式测得鳃细胞活力：鳃细胞活力（%）=处理组对照组*100%。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 浙江大学 一种使用鱼鳃细胞测定微藻溶血活性的方法