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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明公开了重组猪δ冠状病毒感染性克隆及其构建方法和应用，包括以下步骤：第一轮基因重组扩增打靶片段；电转化打靶片段得到阳性克隆；将得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到表达目的基因的PDCoV感染性克隆。本发明建立了基于细菌人工染色体的PDCoV反向遗传学系统，通过Red同源重组技术，在体外快速高效地编辑PDCoV基因组，为研究病毒的分子生物学特性、致病机理以及开发基因工程疫苗提供有力的技术平台，该方法高效便捷、特异性强，为体外编辑PDCoV基因组及其它病毒基因组提供了新的方法。

主权项：1.一种重组猪δ冠状病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）扩增打靶片段b-Nluc-I-SceI-Kan-c或b-P2A-GFP-I-SceI-Kan-c：以pBeloBAC11为模板，使用引物对I-SceI-CATproF和I-SceI-CATproR，扩增I-SceI-CATpro片段；以pET30a为模板，使用引物对KanF和KanR，扩增Kana片段；以I-SceI-CATpro片段和Kana片段为模板，使用引物对I-SceI-CATproF和KanR，通过overlapPCR扩增得到片段I-SceI-Kan，再将片段连接进入T载体，最后得到pMD19-T-I-SceI-Kan，以pMD19-T-I-SceI-Kan为模板，使用引物I-SceI-CATproF和KanR扩增含有I-SceI酶切位点和抗性筛选基因的I-SceI-Kan片段，并切胶纯化，以pUC57-Nluc为模板，使用引物PD-NlucF和PD-Nluc-a-ISceIR扩增得到Nluc基因的前半段Nluc-1；使用引物PD-Nluc-aF和PD-NlucR1扩增得到Nluc基因的后半段Nluc-2，以Nluc-1片段与I_SceI-Kan片段为模板，以PD-NlucF2和KanR作为引物，overlapPCR扩增得到Nluc-1-I-SceI-Kan片段；再以Nluc-1-I-SceI-Kan片段和Nluc-2片段为模板，以PD-NlucF2和PD-NlucR2作为引物，通过overlapPCR方法扩增同时包含PDCoV-M基因下游的50bp同源臂以及PDCoV-NS6基因下游的50bp同源臂的打靶片段b-Nluc-I-SceI-Kan-c，其中，I-SceI-CATproF：TAGGGATAACAGGGTAATTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC，I-SceI-CATproR：TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG，KanF：GATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACGKanR：GTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGPD-NlucF：CGCTCGCCTGTATAAGTATATGTAATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGPD-Nluc-a-ISceIR：CAATTACCCTGTTATCCCTACGTCGATTACCAGTGTGCCAPD-Nluc-aF：TATTGGTGCCCTTAAACGCCTGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCPD-NlucR1：CTTTAATTTAATTCATCTTCAATCATTACGCCAGAATGCGTTCGCPD-NlucF2：CCATAACCACTTCAAAGGCCGGTGACGCTCGCCTGTATAAGTATATGTAATGPD-NlucR2：GTGCAGCCATGATAGATTGGTGTCAAAACTTTAATTTAATTCATCTTCAATCA；以lentiCRISPRv2质粒为模板，使用引物对P2AF和P2AR，扩增片段P2A，以pEGFPC3质粒为模板，使用引物对GFPF和GFPR，扩增片段GFP；以片段P2A和片段GFP为模板通过overlapPCR扩增得到片段P2A-GFP，再将片段P2A-GFP连接至T载体，得到pMD19-T-P2A-GFP，以pMD19-T-P2A-GFP为模板，使用引物PD-NS6-P2AF1和PD-NS6-GFP-a-ISceIR扩增得到GFP基因的前半段P2A-GFP-1；使用引物PD-NS6-GFP-aF和PD-NS6-P2A-GFPR1扩增得到GFP基因的后半段GFP-2，以pBAC-PDCoV为模板，使用引物PD-NS6-3F和PD-NS6-3R扩增NS6基因3’端的基因，命名为NS6-3片段，以P2A-GFP-1片段与I-SceI-Kan片段为模板，以PD-NS6-P2AF1和KanR作为引物，overlapPCR扩增得到GFP-1-I-SceI-Kan片段；再以GFP-1-I-SceI-Kan片段、GFP-2片段和NS6-3片段为模板，以PD-NS6-P2AF2和PD-NS6-3R作为引物，通过overlapPCR方法扩增包含PDCoV-NS6基因下游的50bp同源臂以及PDCoV-N基因上游的50bp同源臂的打靶片段b-P2A-GFP-I-SceI-Kan-c；P2AF：GCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCGGCGCAACAAACTP2AR：GATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGFPF：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGFPR：CGGCATGGACGAGCTGTACAAGPD-NS6-P2AF1：AAGTCATTCTTGAAGATGAATTAAATGGATCCGGCGCAACAAACTTCPD-NS6-GFP-a-ISceIR：CAATTACCCTGTTATCCCTATCCTCCTTGAAGTCGATGCCCPD-NS6-GFP-aFAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCGTTCGAGGGCGACACCCTGPD-NS6-P2A-GFPR1GTGTCAAAACTTTAATTTAATTCATCTTCAATCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCPD-NS6-3FTTGAAGATGAATTAAATTAAAGTTTTGACACCPD-NS6-3RAGCGGAACTCCATTGCCACGAAACTGPD-NS6-P2AF2ACTTTATCATTCGACCATCGCTCCAAGTCATTCTTGAAGATGAATTAAAT；2）电转化打靶片段b-Nluc-I-SceI-Kan-c或b-P2A-GFP-I-SceI-Kan-c进行第一轮基因重组得到阳性克隆；3）将步骤2）得到的阳性克隆通过第二轮重组去掉酶切位点和抗性基因得到重组PDCoV感染性克隆；所述PDCoV-M基因下游的同源臂、PDCoV-NS6基因下游的同源臂、PDCoV-NS6基因下游的同源臂和PDCoV-N基因上游的同源臂的序列分别如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示。

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百度查询： 扬州大学 重组猪δ冠状病毒感染性克隆及其构建方法和应用