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申请/专利权人：复旦大学

摘要：本发明属于分析化学技术领域，具体为一种基于相转变结合FRET的FcRn小分子拮抗剂的筛选方法。本发明将FRET过程所需的荧光供体染料标记在IgG上，荧光受体染料标记在相转变型材料P4VP‑SSO3Na‑4VP上；相转变型材料可在环境pH发生改变时随之发生可逆的物相转变，当该材料从均相体系转变为非均相体系时会将溶液中游离的IgG包埋于体系内，拉近FRET过程荧光供体与受体的距离，从而检测到FRET体系中受体的荧光信号；并进一步检测化合物是否对FcRn具有拮抗作用，筛选FcRn小分子拮抗剂。本发明克服了部分小分子化合物没有合适位点进行染料标记的不足；具有可重复性，实验成本较低，可以实现FcRn小分子拮抗剂的高通量、快速筛选。

主权项：1.一种基于相转变结合FRET的FcRn小分子拮抗剂筛选方法，其特征在于，具体步骤为：1将FRET过程所需的荧光供体染料标记在IgG上：以Cy3作为供体染料，将其标记在IgG上；具体地，将IgG与磺化Cy3-NHS活化酯连接；整个标记过程在pH＝5～7的PBS体系中进行，Cy3与IgG的摩尔比为1:5～1:10，15～30℃条件下避光于混匀仪中混匀过夜，标记完成后以超滤或透析的方式除去游离的染料；2将FRET过程所需的受体染料标记在相转变型材料P4VP-SSO3Na-4VP上：具体地，选择Cy5-amine与P4VP-SSO3Na-4VP进行标记；整个标记过程在pH5～7的PBS体系中进行，Cy5与P4VP-SSO3Na-4VP的摩尔比为1:5～1:10，15～30℃条件下避光于混匀仪中混匀过夜；标记完成后以超滤或透析的方式除去游离的染料；3包板：配制浓度为400～500nM的FcRn溶液，利用排枪加入到高吸附的孔板中，每孔加入20～40μL，加液过程中枪头要伸至板底，摇匀且无挂壁；放置在4～10℃的条件下过夜；4封闭：弃去包板的孔中的FcRn溶液，每孔中立即加入含1％BSA的PBST溶液80～100μL，在30～37℃的条件下放置至少1小时，然后弃去孔中溶液，如不立即使用，可暂时放置于-20℃条件下保存，立即使用则进行下一步；5洗板：配制pH为5～7的PBST溶液，每孔中加入80～100μL上述溶液，稍作振荡后弃去溶液进行拍板，直至孔中没有溶液残留，该过程重复3次；6加入待筛化合物：将待筛化合物与IgG-Cy3等比例混合，每孔加入30～40μL混合溶液，在30～37℃的条件下孵育1～1.5h；7转板并加入相转变型材料P4VP-SSO3Na-4VP：具体地，将孔板中每孔体积为30～40μL溶液转移到用于检测荧光的不透明黑色孔板中，每孔再加入浓度为1～5mgmL的P4VP-SSO3Na-4VP-Cy5溶液30～40μL；8调节pH至出现相变：每孔中精确加入5％的H3PO4溶液1～5μL以调节pH，使P4VP-SSO3Na-4VP出现相变，不要振摇；避光条件下静置至少10min待相变趋近于完全；9荧光检测：用可检测荧光的酶标仪检测相应孔的荧光信号值，每孔多点取值≥5取平均值作为该点的最终结果；检测条件：Ex＝500～550nm，Em＝620～670nm。

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